谷氨酰胺转胺酶参与链霉菌分化的分子机制

链霉菌是一种重要的工业微生物，目前世界上超过三分之二的抗生素和很多重要的工业酶制剂都由链霉菌生产（链霉菌在分化过程中合成）。课题组2008年在研究链霉菌谷氨酰胺转胺酶(TGase)活化机制时,发现TGase参与了链霉菌的分化过程。为揭示TGase在链霉菌分化中的分子机制，本课题从基因、蛋白和细胞水平对其进行研究。课题拟利用反向PCR对TGase基因上游调控序列进行分析，并通对启动子、操纵子等调控序列的调控方式进行验证，揭示TGase基因表达的调控机制；采用荧光蛋白融合表达对TGase催化区域进行定位，研究TGase参与分化的生物化学机制；通过构建TGase基因阻断突变株，对细胞表型进行分析，确定TGase参与分化的生理学机制。本项目成果将为链霉菌和TGase相关的生物化学和微生物学研究提供原创性新发现，同时将促进链霉菌分化相关的重要工业生物产品（抗生素、酶制剂等）的生产。

项目分析和鉴定了谷氨酰胺转胺酶（TGase）基因表达调控序列的组成和功能。通过分子改造对TGase前导肽、成熟酶N端及C端序列的结构和功能进行了验证；通过TGase基因阻断突变株的构建和表型分析揭示了TGase参与链霉菌分化过程的生物学机制。通过分子改造和发酵过程优化提高了TGase的酶学性质和发酵产量。通过反向PCR扩增 Streptomyces hygroscopicus pro-TGase上下游大小为2889 bp基因片段，通过序列分析发现：TGase酶原区序列具有强烈的信号肽特征；在TGase开放阅读框上游约500 bp的位置存在一个可能的启动子序列。通过对启动子前后序列的缺失，鉴定了启动子核心区域，并发现了启动子调控序列，为该启动子的应用提供了基础。根据TGase的编码基因，利用软件结构模拟对TGase的分子结构进行分析，通过对TGase的分子改造，对TGase前导肽、成熟酶N端及C端序列的结构和功能进行了验证。通过分子改造，获得TGase酶催化效率和热稳定性的提升，并实现了在大肠杆菌中的高效表达。通过在S. hygroscopicus中对TGase基因进行敲除，获得表型发生变化的突变株（分化受到抑制），证实TGase参与了链霉菌的分化过程。进一步通过环境胁迫延长TGase分化周期的时间，使TGase的分泌量得到提高。项目完成预期目标，发表论文6篇，其中SCI论文5篇。申请专利国家发明专利4项，授权国家发明专利2项。培养博士研究生3人，硕士研究生1人。