对调控小鼠胚胎干细胞发育多能性的关键基因的筛选及功能研究

胚胎干细胞是细胞替代性治疗的理想来源，具有广阔的应用前景，但其建立和保持发育多能性能力的分子机制尚不清楚，极大地限制了其临床应用。因此，寻找调控胚胎干细胞发育多能性的关键基因意义重大。白血病抑制因子介导的信号通路是小鼠胚胎干细胞维持自我更新的重要途径，但不是唯一途径。为寻找在缺乏白血病抑制因子培养条件下能维持胚胎干细胞特性的新关键因子，我们应用了便捷高效的可大规模突变基因的工具PiggyBac转座子，并筛选到了数个与多能性相关的候选基因。在本项目中我们计划：1）进一步筛选多能性相关的新基因；2）通过过表达及RNA干扰等手段确定和分析细胞表型；3）通过亲和层析、质谱分析等技术寻找相互作用蛋白及通过基因芯片分析下游效应分子，探讨新基因的功能及分子机制。该研究将有助于阐明胚胎干细胞发育多能性建立和维持的分子机制，并为胚胎干细胞体外大量扩增、定向诱导分化提供新的思路。

我们基本达到了本项目的预期目标，完成了以下工作:.1) 应用了便捷高效的可大规模突变基因的工具PB转座子筛选了在缺乏白血病抑制因子培养条件下能维持胚胎干细胞特性的新因子。.2）具体研究了Cited1对胚胎干细胞发育全能性的影响。我们的研究发现Cited1在分化过程中表达明显上调，并在滋养层干细胞中具有较高的表达水平；在小鼠胚胎干细胞中过表达Cited1，细胞失去克隆状生长形态，发生了分化，荧光适时定量PCR显示，全能性分子标记表达水平下调，三胚层分子标记表达水平变化不大，而胚外滋养层的分子标记表达水平明显上调，说明Cited1促进胚胎干细胞向滋养层分化；在分子机制上，我们的研究发现，CR2结构域对于Cited1的功能是必需的，而泛素蛋白连接酶RLIM则会影响Cited1的功能。关于Cited1的功能研究的文章正在撰写中。.3）我们还研究了Ssbp3在胚胎干细胞中的功能。在小鼠胚胎干细胞中过表达Ssbp3，干细胞克隆边缘发生了分化，荧光适时定量PCR显示，胚外滋养层和原始内胚层的分子标记表达水平明显上调，说明Ssbp3促进胚胎干细胞向胚外细胞的分化；我们计划通过亲和层析、质谱分析寻找其相互作用蛋白，通过芯片表达谱分析寻找其影响的下游基因或参与的信号通路来进行机制方面的研究。.4）此外，我们还对胚胎干细胞染色质重建复合体支架蛋白SRG3的泛素化修饰进行了研究，发现泛素蛋白连接酶Wwp2可泛素化修饰SRG3并促进它的降解。相关论文已被BBRC（Biophysical and Biochemical Research Communications）接收。.5）项目执行期间的奖励：教育部自然科学奖二等奖（第三完成人）项目名称：胚胎干细胞及早期胚胎发育的分子调控机制研究.综上所述，我们在项目执行期间，有一篇标注受该项目支持的SCI论文被接收，还有一篇论文正在撰写中，并且项目主持人作为第三完成人获得2011年教育部自然科学奖二等奖，基本完成了本项目的预期目标。