基于功能化氧化石墨烯激活的M2a/M2c巨噬细胞对调控牙周组织再生的相关研究

Functional tissue or organ regeneration is usually compromised by inflammation and fibrosis. Activation of alternative macrophages (M2) has emerged as a key area of resolving inflammation, controlling tissue homeostasis and disease pathogenesis. Our preliminary studies indicated that locally activated M2 macrophage facilitated periodontium complex-like tissues reconstruction in a dentition defect model of nonhuman primates. However, it is reported that some nomenclature of M2 subsets might be associated with pathological fibrosis, and it is difficult to preserve the bioactivity of the delivered proteins for macrophage activation in vivo. Dual-functionalized GO derivative could serve as an antioxidant and an effective gene carrier for M2 macrophage polarization. The present study construct gene delivered graphene oxide system targeting M2a/M2c polarization, and compare the effect of M2a or M2c on the cementoblastic/osteoblastic/fibroblastic differentiation of dental follicle cell sheets. In order to explore targeted genes regulating functional periodontal regeneration, the related gene expression and signaling pathway are analyzed by RNA-seq. Models of periodontal fenestration defects and tooth dentition defects in Rats are constructed to evaluate the effect of M2 subsets on modulating periodontal tissue regeneration. Our project aims to promote functional tissue repair without fibrosis by modulating appropriate M2 subsets.

炎症及纤维化严重制约着组织器官再生过程。申请人前期研究发现替代激活巨噬细胞（M2）有望促进多向排列的牙周膜纤维重建，有利于咀嚼功能恢复。然而，某些M2亚型的存在也可能导致病理性纤维化形成；此外，尚未建立M2巨噬细胞的高效激活体系。双聚合物的功能化氧化石墨烯作为一种新型纳米载体材料，不仅可以降低活性氧释放、抑制炎症反应，又可以负载特定基因诱导M2巨噬细胞分化，促进组织修复。本项目拟首先采用纳米级的双功能化氧化石墨烯作为质粒载体，分别特异性激活组织修复相关M2巨噬细胞亚型（M2a、M2c），然后比较两种亚型在调控牙囊细胞向牙周形成细胞分化的不同，通过RNA-seq筛选相关差异基因及信号蛋白，探索促功能性牙周组织再生的调控蛋白。进一步以大鼠牙周组织缺损模型及牙缺失模型评价M2a、M2c在牙周组织再生中的调控作用，旨在探索特异性高效激活的M2巨噬细胞亚型用于促进损伤组织功能性修复，避免纤维化形成。

项目组前期研究发现替代激活巨噬细胞（M2）有望促进多向排列的牙周膜纤维重建。M2a、M2c巨噬细胞亚型在组织重建中发挥不同作用，为研究其对牙源性干细胞成牙分化及促进生物牙根再生的影响，本研究（1）构建特异性激活M2a/M2c的复合物体系—MGC并进行表征分析，所获得的的MGC转染人THP-1细胞系，反复流式细胞术及Real-time PCR鉴定，结果发现MGC对人THP-1更多的是被内吞，对于巨噬细胞亚型诱导效果不佳；进一步改用重组蛋白诱导M2a(CD206+CD209+CD163+CD16−MerTK−)细胞及M2c(CD206-CD209-CD163+CD16+MerTK+)细胞形成；（2）制备M2a、M2c条件培养基，培养牙囊干细胞（DFCs）7天后进行TMT定量蛋白组学分析，所获得的差异蛋白进行KEGG pathway分析，结果发现氧化磷酸化水平上调、糖酵解能力及HIF-1信号通路下调；线粒体氧化磷酸化是间充质干细胞分化的标志，为此，展开深入研究，结果显示M2a/M2c条件培养基诱导后DFCs细胞增殖增多，成牙本质分化相关蛋白COL-I、DMP-1、DSPP及成牙周分化相关蛋白Periostin、KER6B、ALP、OPN、RUNX2表达上调，成神经成血管相关蛋白FR2、PDGF表达上调，提示诱导后DFC成牙分化能力上调。本部分阐明了M2巨噬细胞促进DFCs成牙分化的机制；（3）比较不同来源TDM组成，Label-free蛋白组学显示人TDM与猪TDM交集蛋白245个，N-糖基化蛋白73个，包含诱导成牙分化的胶原蛋白及非胶原蛋白，其中非胶原蛋白如SIBLING家族（如OPN、DMP1、BSP、DSPP等）、蛋白多糖类（如Biglycan、Decorin）、磷酸化蛋白等作为矿化过程的介导物质均可促进牙源性干细胞成牙分化，本部分阐明TDM构建成牙诱导微环境的机制：（4）以人DFCs与猪TDM为复合体在恒河猴牙缺失模型进行生物牙根重建，局部富集M2巨噬细胞既可以抑制炎症反应，又可以促进牙槽骨-牙周膜-牙骨质结构形成。本研究首次提出M2巨噬细胞促进MSCs氧化磷酸化代谢模式，为干细胞治疗提供了新的研究策略。