Cry1Ab毒素抗独特型单链抗体生物活性形成机制研究

Cry1Ab toxin is one of the most widely successful application insect resistance toxin gene resources in transgenic crops; meanwhile there are also ecological risks as well as potential security problems to humans and other mammals. It will be important scientific merit to exploit novel protein resources which can mimic bioactivity of Cry1Ab toxin. Our studies have found that employing phage display technology to obtain anti-idiotypic single chain antibodies (Ab2β-scFvs) mimicked Cry1Ab toxin bioactivity was a feasible approach. However, there are no researches on formation mechanism of Ab2β-scFv bioactivity. This project will utilize molecular docking techniques to predict key amino acid sites involved in binding to target insect’s receptor BBMV from different bioactivities of Cry1Ab toxin Ab2β-scFvs, guiding Ab2β-scFvs rational molecular design and modification by in vitro high-frequency mutations, getting high bioactivity Ab2β-scFvs mutants through combination experiments and biometric analysis, it can provide the important technical support to address how to expand the novel protein resources mimicked bioactivity of Cry1Ab toxin using modern molecular biology techniques, and explore Cry1Ab toxin Ab2β-scFvs bioactive formation mechanism.

Cry1Ab毒素是目前转基因作物中最为广泛成功应用的抗虫毒素基因资源之一，但同时也存在着生态风险以及对人类和其它哺乳动物的潜在安全隐患，开拓具有模拟Cry1Ab毒素生物活性的新型杀虫蛋白资源具有重要的科学价值。实验室研究发现利用噬菌体展示技术制备具有模拟Cry1Ab毒素生物活性的抗独特型单链抗体（Ab2β-scFv）是一条可行途径，但是对于Ab2β-scFv的生物活性形成机制还未开展研究。本项目利用分子对接技术对不同活性Cry1Ab毒素Ab2β-scFvs参与靶标昆虫受体BBMV结合的关键氨基酸位点进行预测，指导体外高频突变对Ab2β-scFvs进行理性分子设计和改造，通过结合试验和生物测定试验获得高活性的Ab2β-scFvs突变体，为解决如何利用现代分子生物技术拓展模拟Cry1Ab毒素生物活性新型蛋白资源，探索Cry1Ab毒素Ab2β-scFvs生物活性形成机制提供重要的技术保障。

前期研究利用噬菌体展示技术和正负筛选策略，获得不同生物活性Cry1Ab毒素抗独特型单链抗体（Ab2β-scFvs）。本研究利用分子模拟指导体外高频突变对Ab2β-scFvs进行理性分子设计和改造，结合试验验证获得高活性的Ab2β-scFv突变体，探索Ab2β-scFvs模拟Cry1Ab毒素的生物活性形成机制以及提高Cry1Ab毒素Ab2β-scFvs的生物活性。首先，利用抗独特型抗体理论和噬菌体展示技术，筛选制备模拟Cry毒素杀虫活性的抗独特型单链抗体被证明是一条可行路径。本研究中，对筛选制备的候选抗独特型单链抗体进行与毒素竞争结合受体以及分子互作分析，不但可以确定能够模拟Cry毒素生物活性的抗独特型单链抗体，而且可以知道抗独特型单链抗体与受体结合的分子动力学，便于我们获得“快结合-慢解离”的高亲和力抗独特型单链抗体。其次，利用分子模拟技术辅助体外高频突变，构建突变库是获得更高生物活性抗独特型单链抗体的有力保障。通过同源建模和分子对接，确定抗独特型单链抗体的结合模式及结合关键氨基酸位点，对其进行饱和突变，然后进一步通过筛选，获得高活性的突变体。最后，对获得高活性的突变体以及母体材料进行综合比对分析，最终我们可以确定高活性抗独特型单链抗体中关键结合区域中氨基酸分布及其组成特征。