基于植物纳米纤维作为底物的内切纤维素酶持续作用机制的研究

Endo-glucanses have played an important role in the modification of fibre in papermaking and textile industry. A novel bifunctional endo-/exo-type processivity of endo-glucanase was found out, and it has a great value for modification of plant fibre. However, the mechanism of processive endo -glucanase is not very clear. Since the structure and shape of nano fibrillated cellulose (NFC) almost as same as the mircofibre in plant cell wall, it will convenient to analyze the action manner of enzyme if NFS were used as an enzymatic substrate. Base on previous works, in this study, a nano fibrillated cellulose (NFC) will be hydrolysed as enzymatic substrate, to investigate the hydrolysis mechanisim of processive endo-glucanase EG1 from Volvariella volvacea. As analytical method, high performance liquid chromatography(HPLC), fluoroscope, immunochemist, quartz crystal microbalance (QCM), Transmission Electron Microscope(TEM) and Atomic Force Microscope (AFM) will be used to this research, and the creation manner of soluble production by EG1, kinetic of hydrolysis and adsorption of enzyme on substrate will be analyzed. The goals of these works are to clarify the mechanism of hydrolysis of processive EG1 on NFC, reveal the internal relationship between processivity of EG1 and structure and shape of NFC. Moreover, Effects of EG1 treatment on structure of NFC will be found out. The results of this research will replenish the theoretics of enzymatic hydrolysis of cellulases for crystalline cellulose, and provide guidance for application of processive endo-glucanase in modification of plant fibre.

内切纤维素酶已经在造纸和纺织等行业纤维改性的应用中发挥了重要作用，持续作用能力是超出传统认知的内切纤维素酶的新特性，酶的这种特性在植物纤维的改性中将具有更大的应用潜力，但目前作用机理还不十分清楚。基于植物纳米纤维（NFC）基本保持了细胞壁中微纤丝的结构和形貌的特点，用作酶解底物更便于观察和分析酶的作用过程和方式。项目拟将具有持续作用能力的草菇内切纤维素酶EG1作为研究对象，以纳米纤维作为酶解底物，利用高效液相色谱、荧光标记、免疫化学、电镜和原子力显微镜等手段，通过对EG1水解纳米纤维时主要可溶性产物产生的方式、酶解动力学、酶在底物上的吸附位点及吸附/脱附动力学的解析，阐明EG1的内切和外切双功能持续作用机制；揭示EG1持续水解能力与纳米纤维形态和结构的内在关系；进而研究EG1处理对NFC结构的影响。研究结果将丰富纤维素酶水解理论，为具有持续作用能力的内切纤维素酶的应用提供理论指导。

内切纤维素酶的持续作用是部分内切酶所具有的内切/外切双功能。受来源限制，尤其白腐真菌持续内切纤维素酶，目前研究相对较少，其作用机理以及作用特点还不十分清楚。本项目以草菇（Volvaria volvacea）内切纤维素酶EG1(VvEG1 )及其催化域突变体VvEG1(CD )为主要研究对象，研究了纤维素底物结构性能对其持续作用能力的影响；探讨了酶的持续作用能力随处理条件变化的规律。通过石英晶体微天平、电镜技术和DAP荧光标记等手段解析了VvEG1对天然纤维素底物持续作用的模式。. 研究发现，当VvEG1用量和水解时间达到确定值后其持续作用能力趋于稳定。VvEG1水解无定型纤维素的持续作用能力高于天然结晶纤维素，但对于天然结晶纤维素，其持续作用能力随结晶度变化不大。不同聚合度的天然纤维素底物，VvEG1持续水解能力具有不同的规律，聚合度较低的纤维素底物，酶水解初期持续作用能力较高，但是随着水解时间的延长，聚合度较高的纤维素底物酶的持续水解能力提高较快，其最终持续水解能力远高于聚合度低的纤维素底物。 VvEG1的持续作用能力与其在底物上的吸附性能有关，无定型纤维素吸附酶的能力最强，对应其较高的持续作用能力，而对天然结晶纤维素，VvEG1的持续作用能力又不完全与酶的吸附能力相关；DAP标记后的研究结果显示，VvEG1的可溶性产物来源于外切作用的比例高于普通的内切纤维素酶。根据研究结果，推测VvEG1持续作用模式为：VvEG1更倾向吸附于天然纤维素的无定型区；VvEG1初始水解作用同时有两种方式，一种为传统的内切作用，另外一种是从纤维素的还原末端开始的外切作用，产物主要为纤维四糖；初始作用后VvEG1对初始作用产物进行二次水解，将产物纤维四糖水解为纤维二糖或者纤维三糖和葡萄糖。此外，初步应用研究结果显示，VvEG1预处理可明显提高机械法制备CNF的可操作性及产物的长径比。. 本研究从纤维素底物特性的角度展开对内切纤维素酶的持续作用能力研究，其意义在于丰富了纤维素酶水解天然纤维素的理论，同时对于VvEG1在纤维改性、纳米纤维制备及低聚糖制备等方向的合理应用提高理论指导。