内切纤维素酶细胞表面展示与自解离系统的构建及其在定向进化中的应用

在全球能源日益紧张的大背景下，纤维素的酶学降解与利用研究具有尤其重要的理论与实际意义。定向进化是获得性能优良纤维素酶的重要途径。在研究中，由于突变体难以自由地与胞外不溶性纤维素相互作用，所以普遍采用可溶性CMC为筛选底物，其直接后果是获得的突变体对不溶性天然底物的活性没有得到相应提高。本项目在突变库的构建方面，将内切纤维素酶突变体展示在细胞表面，并在酶与载体蛋白之间嵌入具有自剪切功能的蛋白质内含子（Intein），使酶能与筛选底物自由作用；在筛选底物方面，使用不溶性再生无定形纤维素（RAC）为筛选底物，解决了筛选底物与实际作用底物的差异性问题；在筛选措施方面，首先以RAC为唯一碳源进行选择性筛选，然后以低聚合度RAC为底物的透明圈筛选，兼顾了筛选通量和筛选精度的要求。本项目的实施，将为纤维素酶的定向进化建立研究平台，并且在纤维素的直接发酵利用方面也具有广阔应用空间。

内切纤维素酶在纤维素酶系降解纤维质的过程中起到了关键作用，定向进化是获得性质优良的酶的重要途径。内切纤维素酶的定向进化的主要瓶颈是表达在胞内的酶如何能与胞外不溶性纤维素自由相互作用，并建立基于天然底物的筛选方法。针对上述问题，本项目设计构建了两种蛋白表达系统：A，细胞表面展示-自动释放系统，以冰核蛋白（INP）作为载体蛋白，在INP与纤维素酶之间嵌入蛋白质内含子（Intein）,利用Intein 的自剪切功能，将纤维素酶从细胞表面释放出来，以达到突变体酶自由与水不溶性纤维素相互作用的目的，并以红色荧光蛋白为报告蛋白，确定了自动释放的条件；B，细胞表面展示-可控释放系统，在INP与纤维素酶之间嵌入Intein的N-端模体,同时构建了表达Intein的C-端模体的基因工程菌，利用Intein的C-端模体对N-端模体的识别剪切作用,达到突变体酶自由与水不溶性纤维素相互作用的目的，并以红色荧光蛋白为报告蛋白，确定了可控释放条件。.将来源于Clostridium phytofermentans 的两种内切纤维素酶分别连接到了上述两种释放系统，以非结晶纤维素（RAC）为底物，构建的两种基因工程菌都能够在平板上形成透明圈。证明本项目设计构建的内切纤维素酶细胞表面展示解离系统构建成功。在此基础上，构建了两种酶的突变体库。针对细胞表面展示自动解离体系和可控释放体系的特点，分别构建了以RAC为筛选底物的内切纤维素酶的筛选平台，获得了多个酶的性质得到提高的突变体。.本项目设计构建的两种细胞表面展示释放系统，不但能够应用于纤维素酶的定向进化，而且在抗体筛选、全细胞催化等方面也具有广泛的应用潜力。筛选获得的突变体酶，不但能够提供性能得到提高的新酶源，而且能够为酶的分子设计提供参考。.本项目运行期间，培养硕士、博士研究生6名，发表研究论文3篇，申请专利一项，圆满地完成了项目预期目标。