多模块持续性内切纤维素酶CcCel9A的持续性驱动力研究

The processive endoglucanase CcCel9A is origined from a thermophilic anaerobic cellulolytic strain Clostridium cellulosi CS-4-4, comprising of a GH9 module (glycoside hydrolase) and 5 CBMs (carbohydrate-binding module). Since CcCel9A possessed both endo- and exoglucanase activities, it is capable of hydrolyzing crystalline cellulose by itself, cleaving cellotetrose from the non-reducing end of the cellulose chain with higher processivity compared to other processive endoglucanases, which is a kind of scarce cellulase. It’s speculated that the driving force of processive catalysis was from the interaction between modules and substrate and the free energy change of key residues in the active center according to previous study. In order to verify the hypothesis, we plan to study the multi-modular structure and active center of CcCel9A using three levels of methods including mutants construction and their character evaluation, computational simulation of the catalysis process and demonstration of its cellulose degradation pattern. It’s significant to elucidate the mechanisms of CcCel9A, understand the key factors and rate-limiting step that effect its processive catalysis efficiency and propose a catalytic model for GH9 processive endoglucanase, providing theoretical basis for producing robust industrial cellulase candidate.

多模块持续性内切纤维素酶CcCel9A来源于一株高温厌氧纤维素降解菌Clostridium cellulosi CS-4-4，包含1个9家族糖苷水解酶催化模块和5个底物结合模块，并具有内切酶和外切酶双重活性。它可以单独作用于结晶纤维素，从纤维素单链的非还原端开始连续切下纤维四糖且持续性相对较高，是现有纤维素酶中比较稀缺的类型。根据前期研究发现，其持续催化的驱动力可能来源于多模块与底物的相互作用力和活性中心关键位点的自由能变化。为了验证这一假说，解析CcCel9A维持高效持续性的驱动力来源，本项目拟从CcCel9A的多模块结构和活性中心的关键位点研究两方面入手，通过突变体构建及其酶学性质分析、催化过程的计算模拟和底物结构变化的表征三个层面阐明CcCel9A的作用模式，了解影响其持续催化效率的关键因素和限速步骤，提出GH9家族持续性内切酶水解过程的模型，为高效纤维素酶制剂的制备提供理论依据。

多模块持续性内切纤维素酶CcCel9A来源于一株高温厌氧纤维素降解菌Clostridium cellulosi CS-4-4，包含1个9家族糖苷水解酶催化模块和5个底物结合模块，并具有内切酶和外切酶双重活性。它可以单独作用于结晶纤维素，从纤维素单链的非还原端开始连续切下纤维四糖且持续性相对较高，是现有纤维素酶中比较稀缺的类型。本项目从CcCel9A 持续性内切酶截短突变体的构建及其酶学性质分析、CcCel9A 持续性内切酶催化过程的计算模拟及CcCel9A 持续性内切酶点突变体底物降解特性的表征三个方面入手， 明确了CcCel9A中的CBM3b 模块主要负责酶与不溶性底物的结合，而CBM3c 模块主要负责将纤维素单链送入催化孔道。在底物进入活性中心以后，Glc(+1/+2)主要负责破坏纤维素单链与CBM 结合的氢键，而Glc(−4~−1)负责拉动剥离出的单链，两部分相互协同，使酶分子在底物表面持续滑动。当它在纤维素单链上持续滑动不断产生G4 时，是外切酶的工作模式；生成的G4 继续被水解为G1、G2 和G3，是内切酶的工作模式。最终，本项目阐明了CcCel9A的持续性驱动力来源并提出GH9 家族持续性内切酶水解过程的模型，这将有助于认识持续性纤维素水解酶在进化上的巧妙性，了解持续性内切酶与传统持续性糖苷水解酶的差异与协同，解析天然纤维素底物酶解的瓶颈和制约因素，为纤维素酶工程改造提供理论依据。