基于蟾毒内酯类小分子探针的肿瘤细胞Na+/K+-ATP酶信号转导机制研究

Na+/K+-ATP酶是一个有潜力的抗肿瘤药物新靶标，对该靶标及相关信号转导通路的深入研究将为抗肿瘤药物的发现提供新的途径。本课题组发现蟾毒内酯类化合物(包括两种新骨架结构类型化合物)可显著地抑制Na+/K+-ATP酶的生物活性，且抑制作用强弱与其结构有关，并与抗肿瘤活性呈现相关性。本项目拟在以上研究工作基础上，进一步分离鉴定蟾毒内酯化合物，构建配体化合物库，筛选出高选择性的蟾毒内酯类小分子探针，并重点研究小分子探针对Na+/K+-ATP酶生物学功能的影响以及对肿瘤细胞Na+/K+-ATP酶信号转导通路的调控机制，从分子水平上揭示Na+/K+-ATP酶在肿瘤细胞凋亡过程中的作用，为发展基于Na+/K+-ATP酶靶标的新型抗肿瘤药物提供理论依据。

本研究构建了蟾毒内酯类小分子探针库，系统评价了探针分子的体内外抗肿瘤作用并探讨了其构效关系，揭示了其在肿瘤细胞增殖、凋亡和自噬中的作用机理尤其是信号转导通路。研究工作中，还首次发现蟾毒内酯类分子探针作为一种新型的氯通道活化剂具有显著的抗肿瘤作用，从全新的角度阐释了蟾毒内酯化合物的作用机制。现总结如下：（1）从中药蟾酥中分离鉴定60余个蟾毒内酯化合物，其中2个具新骨架结构的蟾毒内酯类化合物、12个新化合物，6个新天然产物，构建了蟾毒内酯类小分子探针库。（2）发现大部分蟾毒内酯化合物均能有效地抑制肿瘤细胞的增殖及抑制Na+/K+-ATPase活性，初步分析了构效关系，其中沙蟾毒精活性显著。（3）发现沙蟾毒精可抑制多种肿瘤细胞的生长，对肝癌的抑制作用最强；沙蟾毒精也能抑制HepG2/ADM裸鼠移植瘤的生长，且在非毒性剂量下，可抑制肝癌细胞的粘附、运动、侵袭和迁移，抑制VEGF介导的肿瘤血管新生。（4）揭示了蟾毒内酯类小分子探针的信号转导机制。①沙蟾毒精可通过显著下调周期相关蛋白导致肝癌细胞周期阻滞在G2/M期；同时沙蟾毒精也能调控线粒体通路MAPK通路和NF-κB通路诱导肝癌细胞凋亡。②沙蟾毒精可诱导肝癌细胞耐药株自噬，且自吞噬阻断剂和siRNA beclin1干扰可明显提高沙蟾毒精导致的凋亡比率，表明自吞噬可能拮抗沙蟾毒精诱导的凋亡。③沙蟾毒精可活化PI3K/Akt/mTOR信号通路，且siRNA Akt和siRNA mTOR干扰可明显提高沙蟾毒精导致的凋亡和自吞噬的比率，而PI3K活化剂预处理可明显降低沙蟾毒精导致的凋亡和自吞噬的比率，表明PI3K/Akt/mTOR通路抑制可能同时参与凋亡和自噬的调控。④蛋白组学研究结果表明，沙蟾毒精可调控线粒体相关蛋白PHB和NME1、细胞骨架蛋白Mcm、Lamin A和LASP1而抑制肝癌细胞增殖。（5）发现蟾毒内酯类小分子探针的可能作用靶标为ClC-3氯离子通道。分子对接研究提示ClC-3氯离子通道可能是蟾毒内酯化合物的作用靶标；膜片钳实验也证实蟾毒内酯化合物可迅速激活ClC-3氯通道，且其抗肿瘤作用与氯通道活化的作用密切相关。蟾毒内酯化合物的抗肿瘤作用以及对肿瘤细胞异常活化的PI3K/Akt信号通路的抑制都是部分依赖于ClC-3氯通道的活化。研究期间发表论文9篇（ＳＣＩ收录7篇）；授权中国专利1项；培养博士生4名、硕士生4名。