小菜蛾和甜菜夜蛾感受异硫氰酸酯类气味受体基因的功能鉴定及比较分析

Glucosinolates and their breakdown products are the secondary metabolites characterized by the Crucifer plants. Among those breakdown products, volatile isothiocyanates (ITC) are the specific signals attracting females for oviposition in Crucifer specialist insects. To identify the olfactory receptor (OR) genes and characterize the function are very important for better understanding of the plant-insects coevolution and insect feeding differentiation, but there is no related study reported yet. The present project is aimed to characterize the ORs for ITC in two moths, a crucifer specialist (Plutella xylostella) and a crucifer generalist (Spodoptera exigua). Firstly, key ITC volatiles attracting female moths will be determined by bioassays; then candidate OR genes for ITC will be screened out by analyses of female antenna transcriptome data followed by female biased expression; thirdly, ORs will be functional analyzed using heterologous expression system Xenopus oocytes coupled with electrophysiological technique; fourthly, the OR genes will be in vivo functionally determined, using the newly developed CRISPR/Cas9 genome editing technique together with the electrophysiological and behavioral assays. At meantime, the relationship between the structure and activity for the ITC will be explored by measuring the activity of ITC with different structure. The results will be helpful for deeper understanding the plant-insect coevolution, and at meantime provide potential target for new pest control technique, and provide guidance for screening of the active volatiles used for pest control.

芥子油苷及其水解产物是十字花科植物的标志性次生物质，其中的挥发性异硫氰酸酯类水解产物（ITC）是吸引专食性蛾类雌虫产卵的特征气味，解析昆虫对ITC特异感受的嗅觉受体（OR）基因及其功能并进行昆虫间比较分析，对于揭示昆虫-植物间的协同进化及昆虫食性的分化机制均具重要意义，但相关研究仍属空白。项目拟以十字花科植物专食性小菜蛾及非专食性甜菜夜蛾为对象，首先测定明确引诱两种害虫产卵的ITC关键组分；然后通过触角转录组、性别差异表达等分析，获得候选OR基因；再后利用蛙卵系统结合双极电压钳技术进行体外功能分析，确定OR基因；最后采用CRISPR/Cas9技术结合电生理及行为测定技术，明确两种昆虫中感受ITC类气味的OR基因及功能，分析不同食性昆虫间的差异；同时测定不同结构ITC及其类似物的活性，探讨构效关系。研究成果将深化对十字花科植物-昆虫协同进化机制的认识，并为害虫高效行为调控技术的开发提供指导。

芥子油苷（GS）是十字花科植物的标志性次生物质，当被昆虫取食进入虫体后被黑芥子酶降解，大量生成异硫氰酸酯（ITC）等有毒产物而发生毒害作用。但十字花科植物专食性昆虫不仅不受其毒害，反而还利用ITC气味来识别进而产卵于十字花科植物，但昆虫识别ITC气味的分子机制一直不清楚。课题组以小菜蛾为对象展开研究，鉴定了吸引小菜蛾产卵的3种关键ITC气味物质，明确了特异性感受这些活性ITC物质的受体基因，从嗅觉角度揭示了十字花科植物专食性昆虫的寄主适应机制。主要结果如下：1）对13种代表性ITC化合物进行测定，发现其中的3种ITC（苯乙基异硫氰酸酯、4-戊烯基异硫氰酸酯和3-甲硫基丙基异硫氰酸酯）可以引起雌蛾显著的EAG反应和产卵选择性，证实ITC物质是吸引小菜蛾雌蛾产卵的重要嗅觉信号。2）在对OR基因进行序列比对、克隆验证及转录组测序分析的基础上，分析OR基因的性别和组织表达差异，发现其中的12个OR为雌虫触角高表达（雌/雄≥ 2.00），作为候选的ITC受体基因。3）利用蛙卵-双电极电压钳系统，逐一测定候选OR对13种ITC物质、25种植物挥发物和11种昆虫性信息素组分的电生理反应，发现OR35和OR49对7种ITC物质有电生理反应，且对3-甲硫基丙基和4-戊烯基异硫氰酸酯的反应最强，但OR35的敏感性明显高于OR49；2个OR对植物挥发气味和昆虫性信息素组分均没有反应，说明2个OR对ITC物质为特异性感受。4）利用CRISPR/Cas9基因编辑等技术进行活体功能证实，发现2个OR的单基因敲除品系的雌蛾对3种关键ITC气味的EAG反应和产卵选择性显著降低，双基因敲除品系则丧失了上述反应；利用拟南芥GS敲除品系（不产生ITC物质）和野生拟南芥进行比较测定，也获得了相同的结果。研究结果对于深入理解昆虫的寄主适应和食性分化机制具有重要意义，也为开发基于嗅觉调控的十字花科植物专食性昆虫的新型防治技术提供了新思路和新靶标，具有重要的潜在应用价值。