小菜蛾普通气味结合蛋白GOBPs基因克隆与功能研究

The general odorant binding proteins (GOBPs) play crucial roles in host location and selection for insects functioning as solvant and transprot vector of host plant volatiles. Understanding the functional characteriastion of GOBPs in olfaction could not only help disclose the olfactory mechanism of insect, but also provide new strategies for insect pest management through regulating insects' communication with semiochemicals. The diamondback moth Plutella xylostella (L.) is among the key pest insects on Cruciferous vegetables worldwide for its resistance to a variety of insecticides.Semiochemicals are a promising way of control, but its application is hindered because of unclear function of GOBPs. Based on the genome and transcriptome data of P. xylostella,12 putative GOBPs genes had been screened. This proposal is to identify and clone the 12 GOBPs genes of DBM, and construct plasmids to express the GOBPs, which will be purified to study the spatiotemporal expression pattern by immunohistochemistry together with real time PCR,to investigate the GOBPs binding property using fluorescence binding assays. The research aims to uncover the function of GOBPs in chemical communication for DBM, to demonstrate the olfactory mechanism of GOBPs in DBM. The results are supposed to provide theoretical and technical support for screening effective host plant volatiles to detect and control not only DBM but also other pest insects, and will be meaningful for understanding the mechanism of olfaction and host selection in insects.

昆虫普通气味结合蛋白（GOBPs）负责溶解和运输植物挥发性物质，在昆虫寄主定位、选择等行为中发挥重要作用。解析GOBPs在嗅觉识别中的作用，既有助于阐明昆虫嗅觉识别机制，还可为利用化学信息素调控害虫通讯行为进行害虫治理提供新策略。本项目拟从前期获得的12个小菜蛾GOBPs预测基因入手，对其进行克隆、鉴定，采用生物信息学与原核表达等技术预测和分析小菜蛾GOBPs生化特征；纯化原核表达的重组蛋白，利用实时定量PCR、western blot和免疫组化技术解析小菜蛾GOBPs基因的时空、性别表达模式；利用GOBPs与植物挥发物结合的专一性，通过荧光结合试验研究小菜蛾GOBPs对气味信息分子的结合特性。以期系统分析小菜蛾GOBPs在嗅觉识别中的作用，为揭示小菜蛾嗅觉识别机制奠定理论基础；为利用GOBPs靶向筛选寄主植物挥发物有效防治小菜蛾提供理论依据，同时也可为诠释其它昆虫的嗅觉机理提供参考。

昆虫利用其敏感而复杂的嗅觉系统感知环境中各种化学信息素，寻找和选择产卵地、寄主以及配偶等。而气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）在昆虫专一性识别外界环境的第一步生化反应中起着决定性作用，但其确切的功能尚未明确。本研究以小菜蛾为研究对象，基于小菜蛾基因组与表达谱数据，采用生物信息学方法与实时荧光定量PCR技术，对预测的小菜蛾气味结合蛋白基因进行了鉴定；利用PCR技术克隆和鉴定了9个小菜蛾普通气味结合蛋白基因；利用原核表达系统表达了相应的9个重组蛋白，并利用镍柱纯化重组蛋白；体外测定了重组蛋白与39种挥发性气味物质的结合能力；最后利用荧光免疫技术结合激光共聚焦显微镜对这4个普通气味结合蛋白在组织中的分布进行了定位。具体研究结果如下：.1. 基于小菜蛾基因组数据共预测出39个OBPs基因，分布在20条不同的Scaffold上;.2. 获得9个普通气味结合蛋白基因开放阅读框全长序列，GenBank登录号分别为KT070561、KT070564、KT070560、KT070562与KT070563、KT156677、KT156678、KT156679、KT156676。9个基因编码蛋白含122~167个氨基酸，相对分子量13.83~22.24 KDa，等电点4.41~8.96；均含有气味结合蛋白家族6个保守的半胱氨酸残基与保守结构域。通过氨基酸序列同源性比对及系统进化树分析，PxylOBP6与PxylOBP31聚为一支，PxylOBP12与PxylOBP13聚为另一支，说明它们分属于GOBP不同亚类；.3. 成功构建了pET28a-PxylOBPs重组质粒，将重组质粒导入表达宿主细胞BL21(DE3)中成功表达，Western blot验证蛋白表达成功。圆二色谱测定蛋白二级结构，结果显示均为ɑ螺旋结构；.4．通过荧光竞争结合实验检测了9个重组气味结合蛋白与39种化合物的结合能力，结果显示PxylOBP6和PxylOBP13结合谱广泛，均能与性信息素、醇、醛、酮、酯和烯烃类大部分物质结合，且结合能力也都比较强；.5．通过免疫荧光定位结合激光共聚焦显微镜观察对小菜蛾气味结合蛋白进行定位，PxylOBP12集中分布触角鞭节的端节和触角鞭节各亚节的连接处，在各鞭节亚节上稀疏分布，在毛形感器中并未发现PxylOBP12被标记。