甘蔗叶绿体遗传转化研究

叶绿体遗传转化可以实现外源基因定点整合，无基因沉默，外源蛋白区室化而高表达量，母系遗传高生物安全性。本项目以禾本科高光效C4作物甘蔗叶绿体基因组trnI/trnA基因间隔区为外源基因表达盒插入位点，nptII(G418与巴龙霉素筛选)和aadA(链霉素筛选)为筛选标记基因，gfp为可视报告基因，目标基因添加G10L、rps16、psbA 5'(3')UTR等调控序列，水稻质体Prrn启动子驱动构建甘蔗高效叶绿体表达载体。鱼精蛋白吸附并保护外源DNA，纳米级金粉颗粒携带外源基因表达盒，培养基添加CuSO4，弱光照培养等技术改进，优化基因枪转化参数，分生组织、预培养叶盘为受体，采用亚致死毒性抗生素筛选等技术集成，打破单子叶植物叶绿体转化的同质化技术瓶颈，探索建立甘蔗叶绿体转化体系。为开展甘蔗作为生物反应器生产能源乙醇奠定基础。

叶绿体遗传转化可以实现外源基因定点整合，无基因沉默，母系遗传高生物安全性,较核遗传转化具有巨大的优越性。但是，单子叶植物叶绿体遗传转化迄今尚未成功。本项目采用亚致死毒性抗生素筛选等技术集成，以期打破单子叶植物叶绿体转化的同质化技术瓶颈，探索建立甘蔗叶绿体遗传转化体系。课题组以禾本科高光效C4作物甘蔗叶绿体基因组trnI/trnA基因间隔区为外源基因表达盒插入位点，nptII(G418与巴龙霉素筛选)和aadA(链霉素筛选)为筛选标记基因，gfp为可视报告基因，目标基因添加G10L、rps16、psbA 5’(3’)UTR等调控序列，水稻质体Prrn启动子，烟草16S核糖体RNA (Ntprrn) 启动子以及PpsbA启动子驱动，构建5个甘蔗高效叶绿体表达载体（单筛选标记载体pYNnptII，pYNaadA，pYNnptII-GFP和pYNaadA-GFP以及双筛选标记载体pYNnptII-aadA）。鱼精蛋白或亚精胺等吸附并保护外源DNA，纳米级金粉颗粒（直径0.3µm，0.55µm，0.6µm，或0.1µm-1.0µm）携带外源基因表达盒，优化基因枪转化参数（轰击距离6 cm 或9cm；可裂膜片1100psi、1200psi、1350psi或1500psi；真空度27.5inches或28inches汞柱），培养基添加CuSO4，弱光照培养(33.0µmol/m2/s)等技术改进。分别以CP88-1762和ROC22胚性愈伤组织、分生组织和预培养叶盘为受体，共枪击634枪（nptII筛选标记235枪，aadA筛选标记302枪，双筛选标记97枪）。确定甘蔗植株分化阶段链霉素筛选浓度20 mg/L；胚性愈伤组织筛选浓度巴龙霉素为15mg/L，G418在9 mg/L-15 mg/L之间。明确aadA基因在甘蔗愈伤组织阶段链霉素筛选几乎无效。初步认为缺乏合适筛选标记和甘蔗胚性愈伤组织一旦趋于分化而不能停顿的困难，是未能获得甘蔗叶绿体转化植株的主要原因，推测其也是单子叶植物叶绿体转化迄今未能成功的症结所在。一些研究结果提高了农杆菌介导的甘蔗遗传转化效率，而且缩短了获得转基因植株所需时间。发表学术论文3篇（SCI收录1篇），培养研究生3名。