Cry1Ac-2A-gna融合基因遗传转化甘蔗的研究

甘蔗是重要的糖料和能源作物,甘蔗生产中鳞翅目害虫(大螟、二点螟等)和同翅目害虫(甘蔗绵蚜等)的危害已成为其持续、稳定和健康发展的严重障碍。目前，Bt杀虫晶体蛋白对防治鳞翅目害虫最为有效，而雪花莲凝集素GNA则能有效控制同翅目害虫，因此，本项目选择BtCry1Ac和gna基因，利用具有自我剪切功能的FMDV2A序列连接 Cry1Ac和gna 基因，融合两基因于同一个开放阅读框架(ORF) 中，并由玉米Ubi启动子驱动, 构建单子叶植物高效表达的融合抗虫表达载体, 通过农杆菌介导法转化高产高糖甘蔗品种, 希望通过一次转化获得同时转Cry1Ac和gna 基因的甘蔗, 从而培育抗螟虫和绵蚜等多种害虫的甘蔗新品种。

甘蔗是重要的糖料和能源作物，甘蔗生产中螟虫(鳞翅目)、甘蔗绵蚜(同翅目)等害虫的危害已成为其持续、稳定和健康发展的严重障碍。本研究选择Bt Cry1Ac和gna两个已经证明具有很强抗螟虫和蚜虫能力的抗虫蛋白，采用重叠延伸PCR技术，通过连接多肽FMDV2A序列将Cry1Ac和gna基因相融合，得到Cry1Ac-2A-gna抗虫融合基因，通过农杆菌介导转化甘蔗，实现两个蛋白在甘蔗体内的共表达，以期提高甘蔗对虫害的抵抗能力。 . 本项目的研究工作基本按年度计划执行，很好的完成了以下工作：. 1）构建Cry1Ac-2A-gna融合基因的植物表达载体：采用重叠延伸PCR技术把Cry1Ac、具有自我剪切功能的连接多肽2A和gna基因融合，完成玉米Ubi启动子驱动Cry1Ac-2A-gna的融合杀虫基因植物表达载体pUBG的构建；. 2）通过农杆菌介导法将植物表达载体pUBG转化甘蔗ROC22，经PPT筛选得到大量抗性植株。进一步进行融合基因的PCR检测、Southern blot杂交等检测，获得85个转基因植株，这些转基因植株外源基因的拷贝数以低拷贝为主，1-3个拷贝居多；. 3）转基因植株叶片经过RT-PCR检测，得到66个外源基因表达的转基因株系，进一步取叶片蛋白粗提液进行Bt-Cry1Ab/Ac免疫检测试纸条检测，最后剩余31个外源基因能翻译Bt毒蛋白的株系；. 4）31个转基因植株叶片蛋白粗提液经过GNA雪花莲凝集素ELISA检测，实验结果显示，3个株系没有检测到GNA蛋白，而8个株系外源蛋白表达量较高。. 5）28个转基因株系进行室内抗虫性测定，具有较好抗虫性的有13个株系。. 本团队从甘蔗胚性愈伤组织的培养、转化方法、转化后材料的PPT筛选或甘露糖筛选等方面进行了大量的优化工作，得到了突破性进展，现已建立了一种转化频率高、稳定性好的农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系和PPT除草剂/甘露糖筛选系统。甘露糖筛选效率73.9%，比国际报道的转化率高出约10 倍。