大豆无选择标记叶绿体遗传转化技术体系的建立

针对目前植物叶绿体转基因技术应用范围狭窄以及存在选择标记基因等问题，以大豆为研究对象，基于植物内源重组系统去除选择标记基因的策略，构建大豆无选择标记叶绿体转化载体；在对大豆幼胚转化中各个环节如体细胞胚状体的诱导和增殖、胚状体悬浮培养、胚状体的成熟和再生以及基因枪轰击、抗生素筛选浓度等参数进行优化的基础上，利用基因枪转化方法，将大豆叶绿体转化载体pGm-gfp-aadA（-）导入大豆材料Jack，通过多轮、高压筛选，结合分子检测和GFP荧光蛋白表达研究，获得同质化大豆叶绿体转基因植株；并基于植物内源重组酶系统，通过同向重复序列的环出，将选择标记基因剔除，结合分子检测和抗生素负向筛选，最终获得无标记叶绿体转基因大豆，建立大豆无选择标叶绿体转化技术体系，为新型、安全叶绿体转基因大豆新品种的培育以及利用大豆叶绿体作为生物反应器生产具有重要应用价值的药用蛋白或疫苗奠定基础。

本研究针对目前植物叶绿体转基因技术应用范围狭窄以及选择标记基因安全性等问题，在对大豆幼胚转化中各个环节优化的基础上，基于植物内源重组策略剔除选择标记基因，建立无选择标记大豆叶绿体遗传转化技术体系。主要获得以下结果：构建了基于不同筛选标记（aadA、nptII，epsps）的大豆标记删除叶绿体表达载体。载体中同源序列插入位点为trnI/trn。对大豆幼胚转化中各个环节如体细胞胚状体的增殖和悬浮培养条件以及基因枪轰击、抗生素筛选浓度等参数进行了优化。优化悬浮培养条件为改良F2培养基（含10mg/ L 2 ,4-D，3%蔗糖）；基因枪轰击参数为1100psi，9cm；壮观霉素初始筛选浓度为200mg/ml，高压筛选浓度为300mg/ml。在对大豆叶绿体转化条件优化的基础上，利用基因枪转化法将叶绿体转化载体导入大豆品种Jack，通过6～8轮高压筛选，最终获得叶绿体转化再生植株27株。PCR和Southern杂交检测结果表明，外源片段已整合到大豆叶绿体基因组中，但尚未获得同质化。在去除筛选压力的条件下，通过插入片段中同向重复序列的环出（～1.3kb），删除筛选标记基因aadA表达框。对移栽至温室中的叶绿体转基因植株进行PCR检测结果表明，标记基因aadA已被部分删除。对T1和T2代叶绿体转基因材料进行进一步分子检测结果表明，标记基因aadA已被删除。正反交结果表明，外源片段在叶绿体转基因大豆中以母性方式遗传。本研究初步建立了大豆无选择标记叶绿体遗传转化技术体系。目前将该方法应用于抗虫转基因大豆研究，期望利用叶绿体转基因技术在外源基因高效表达及环境友好等方面的优势，培育高抗鳞翅目害虫转基因大豆新品种。