基于毕氏酵母展示的β-葡萄糖苷酶融合蛋白体系的分子模拟与催化特性分析

烷基糖苷（APG）是新一代绿色环保型非离子表面活性剂，在食品加工等行业中有广泛用途。传统的化学合成制备产物往往纯度较低而无法直接应用，使得酶法成为制备高纯度APG的一个重要方法。本项目将棘孢曲霉来源的β-葡萄糖苷酶以融合蛋白的形式展示在毕氏酵母的细胞壁表面，制备全细胞催化剂用于APG的催化合成。针对酶法制备中存在的问题，本项目采用分子模拟方法，建立基于毕氏酵母表面展示体系的"融合蛋白-溶剂环境"结构模型，分析融合体系中各个亚单位在不同溶剂环境中的相互作用规律，揭示基于表面展示的β-葡萄糖苷酶酶蛋白催化特性变化规律，探讨底物（糖）结合蛋白对APG催化体系的可能作用机理；依据结构模型分析计算，通过定点突变及快速筛选体系获得对长链脂肪醇底物具有高APG合成活性的β-葡萄糖苷酶突变体。研究将为促进酶法合成APG工艺的应用提供指导，对推动我国酶制剂、食品加工及食品添加剂行业的发展具有重要意义。

毕赤酵母表面展示系统是近年来发展较快的微生物表面展示系统之一。外源β-葡萄糖苷酶展示在酵母细胞表面，表现出耐温、耐有机溶媒、回收方便、可重复使用等优良特性，正成为继固定化酶之后新的酶制剂形式。但单位酵母细胞表面展示酶催化效率较固定化酶低是制约其发展的重要瓶颈。了解融合蛋白在酵母细胞表面的分子结构、展示体系中各蛋白元件的相互作用对丰富酵母展示理论和指导改善酵母细胞表面展示效率有重要意义。此外，不同来源的β-葡萄糖苷酶展现出各异的催化行为，通过对β-葡萄糖苷酶的分子建模可以更好地了解其催化规律，对指导构建新酶突变体有重要指导意义。.本课题通过酿酒酵母凝集素NS、絮凝素FS和毕赤酵母壁蛋白GCWn（n=12,19,21,49,51,61）三种展示系统，将来源于棘孢曲霉、泰国红木和木薯的β-葡萄糖苷酶基因展示在毕赤酵母细胞表面。利用串联表达盒和抗性筛选标记差异的方法，实现多个锚定蛋白共表达展示重组毕赤酵母菌株的构建及应用。研究表明，融合蛋白体系不影响细胞的生长。但是不同类型的锚定蛋白及组合会严重影响展示酶蛋白的催化特性。Gcw61p、Gcw51p和Gcw21p较适合构建展示体系，一株三拷贝菌株GS115/BGL-GCW(61×2+51)在研究中展现了极佳的催化性能。课题组全面评价了所有构建成功的展示体系的逆水解和转糖苷合成烷基糖苷能力，并对影响催化合成反应的一些因素如底物浓度、水-醇体系组合以及催化剂用量进行了优化，较好地阐明了表面展示β-葡萄糖苷酶的催化特性。.本课题还根据棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶的晶体数据对其蛋白分子结构、关键氨基酸残基以及底物特异性等特性进行了系统分析。并首次运用同源建模、分子对接方法对其FN3结构域的定位以及对水解活性的影响进行了全面评价，并通过构建一系列突变体验证其生物学功能。课题不足之处在于缺乏合适模板，无法对毕赤酵母壁蛋白进行建模，其与酶蛋白之间的相互作用无法通过生物计算方式来阐明规律。