葡萄酒生境下β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母细胞表面展示研究

β-glucosidase (BGL) is the key enzyme that hydrolyze the aroma glycosides to release free aroma compounds during wine making. According to the fact that BGL from Saccharomyces cerevisiae is mainly located in periplasmic space and inside of the cell which cannot hydrolyze glycosides outside of the cell efficiently during wine making. The main research of this project is to highly express the BGL on the cell surface of S. cerevisiae. Firstly, the BGL of Pichia anomala C84 which is isolated in our previous study was remodeled by using Error-prone PCR technology to relieve the glucose inhibition; Secondly, we try to realize displaying the remodeled BGL on the cell surface of S. cerevisiae with high efficiency and activity by selecting the suitable anchor protein, optimized linker and codon. By studying this project, intends to reveal that which are the key points restrict the BGL activity outside of the cell and preliminary clarify the influencing mechanism between cell surface displaying and BGL activity. The results of this study give the important theoretic foundation and practical experience for construction of S. cerevisiae which have the abiity to enhance wine aroma. It further provides important application value to improve the aroma quality of the wine produced in our country.

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，简称BGL)是水解香气糖苷释放葡萄酒游离香气成分的关键酶，但在葡萄酒酿造中，酿酒酵母的BGL主要位于其周质空间和细胞内，对胞外糖苷的水解作用较弱，因此本项目将酿酒酵母细胞表面BGL高效表达作为研究主题。首先利用易错PCR技术，对前期筛选到的异常毕赤酵母C84的BGL进行定向改造，解除葡萄糖对BGL活性的抑制效应；其次，通过筛选合适锚定蛋白、优化连接序列和优化密码子等方法，实现BGL高效率和高活性的表面展示表达。拟通过本项目的研究揭示制约胞外展示BGL活性的关键点，初步阐明细胞表面展示对BGL活性的影响机制。研究结果为增香酿酒酵母的构建提供了理论基础和实践经验，对提高我国葡萄酒产品的香气质量具有重要的应用价值。

β-葡萄糖苷酶（BGL）对提升葡萄酒品种香气至关重要。在酿酒酵母细胞壁上高效展示BGL是水解香气糖苷的一种新的解决策略。本项目以酿酒酵母BY4741作为宿主菌，通过构建不同类型表面展示表达盒，阐明细胞表面展示对BGL活性的影响机制，另外探究葡萄生境条件对表面展示BGL的酶学特性以及对萜类香气的水解能力。研究结果表明，当BGL表面展示表达盒以质粒形式导入到宿主中，BGL表达极不稳定，不适合在发酵过程中对葡萄醪中的香气糖苷进行水解。将BGL表达盒插入到宿主菌染色体的His3位点，重组菌酶活随着培养时间延长先升高后降低，且都在84 h酶活达到最高。以启动子GPD、锚定蛋白SED1组合使表面展示BGL的酶活最高。以商业酶制剂AR2000和分泌型BGL为对照，考察表面展示BGL在不同浓度的乙醇、葡萄糖和pH下的稳定性。发现葡萄糖对β-葡萄糖苷酶的抑制作用明显，在低浓度葡萄糖下（2.5%），表面展示BGL保留15%的酶活力，而商业酶制剂AR2000则被完全抑制；乙醇对三种形态BGL也存在抑制作用，但三者之间没有明显差距；在低pH下，表面展示BGL表现出较高的稳定性，在pH=3.0时，保留50 %的酶活。通过比对24种表达融合伴侣（TFP，translational fusion partner），发现来源于SED1 的TFP对表面展示BGL酶活提高最为显著，相比对照的α-factor TFP提高了3倍左右。最后，利用表面展示BGL作为全细胞催化，对合成葡萄汁中的香气糖苷进行水解，结果发现，通过表面展示BGL所释放的挥发性物质浓度要远高于其余三组对照，其萜烯醇的总物质含量（78.32±1.72 μg/L），是商业酶制剂AR2000处理的两倍。本项目研究结果为系统改造酿酒酵母，提升葡萄酒香气及品质奠定重要的理论依据和方法基础，具有重要的理论和实践意义。