NO相关氧化应激新通路在甲基苯丙胺致心脑毒性损伤机制中的研究

DDAH1/ADMA/NOS system played a critical role in the METH-induced oxidative stress and that the nitrification level of glutathione S-transferase pi (GSTP1) and the expression of glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH) both increased significantly. It has been reported that GSTP1 might be involved in the cascade reactions with CDK5 and that nitrified GAPDH might be connected to the nuclear transport mediated by siah1. Thus, we would like to propose a new hypothesis that GSTP1-P35/P25-CDK5 pathway and NO/GAPDH/siah1 pathway, which are dominated by the two key factors mentioned above, could play an important role in regulating and mediating the injuries caused by METH-induced oxidative stress. In this research, culture in vitro, molecular biology technology, neurobiology methods and RNA interference will be used to investigate the changes and the regulation of the two key factors, GSTP1 and GAPDH, and to reveal the effect of the two pathways on the METH-induced neurotoxicity, cardiotoxicity and apoptosis. This study is designed to discover the bridges of METH-induced oxidative stress for a further understanding of the oxidative stress mechanisms. In addition, it will also provide basis for a comprehensive explanation of the METH-induced neurotoxicity and cardiotoxicity and help to find new targets for drug therapy.

在前一基金研究中发现DDAH1/ADMA/NOS系统在METH所致的氧化应激机制中有重要作用，发现了谷胱甘肽-S转移酶（GSTP1）硝基化增强，三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）表达上调，GSTP1可能与CDK5等分子发生级联反应，硝基化的GAPDH可能与siah1介导的核转运相关的基础上，提出上述两个重要要素构成的两个通路，GSTP1- P35/P25-CDK5和NO/GAPDH/siah1，可能是介导和调节METH所致氧化应激损伤新途径的理念。因此本研究拟通过体内外实验，用分子生物学、神经生物学、RNA干扰等技术，研究两个通路中主要要素GSTP1和GAPDH的表达变化及调控以及两个通路的调控对METH所致毒性心脑损伤及凋亡的影响，寻找METH氧化应激损伤的中间途径，深入探讨METH的氧化应激作用机制，为进一步阐明METH心脑毒性损伤机制及寻找药物治疗靶点提供基础。

在前一基金研究中发现DDAH1/ADMA/NOS系统在METH所致的氧化应激机制中有重要作用，发现了谷胱甘肽-S 转移酶（GSTP1）硝基化增强，GSTP1可能与CDK5等分子发生级联反应，因此我们提出了GSTP1-P35/P25-CDK5可能是介导和调节METH所致氧化应激损伤新途径的理念。.本研究通过体内外实验，用分子生物学、神经生物学、RNA干扰、构建过表达质粒等技术，探讨了GSTP1-P35/P25-CDK5通路在METH诱导的神经退行性变及凋亡中的作用。我们发现METH通过硝基化GSTP1降低GSTP1的表达量以及GSTP1的酶活性，促进CDK5表达升高，导致神经细胞骨架蛋白Tau的T231位点及S396位点磷酸化水平显著升高；而过表达GSTP1可以部分降低表达增高的CDK5及METH诱导的ROS，对METH导致的PC12细胞和原代黑质神经元凋亡具有保护作用；使用中枢神经系统NOS抑制剂7-NI可有效抑制NO生成、降低硝基化作用，从而对GSTP1起到有效的保护作用，并可通过抑制P35/P25/CDK5的激活从而达到保护Tau过度磷酸化的作用；进一步使用CDK5抑制剂Roscovitine和特异性siRNA探讨CDK5的作用，发现抑制CDK5的表达可显著抑制METH诱导的Tau蛋白的过磷酸化及神经细胞的凋亡,并部分降低了METH诱导内质网应激相关蛋白p-PERK、caspase12、泛素化蛋白和蛋白酶体降解底物CD3-δ的表达。另外，本研究还发现caspase-11/caspase-3通路参与了METH神经凋亡，其中caspase-11可能是METH神经毒性的重要靶点，首次提出炎症因子caspase-11参与METH神经凋亡。本课题深入探讨METH的氧化应激作用机制，为进一步阐明METH神经毒性损伤机制及寻找药物治疗靶点提供基础。除此以外，通过对PC12细胞METH中毒模型进行基因芯片检测，对芯片结果采用GO分析，发现差异表达的基因主要参与的生物过程有核糖体合成、炎症反应、抗凋亡、过氧化氢代谢、氧化应激反应、线粒体钙离子转运、多巴胺能突触传递负向调节等，并分析发现了有16个差异表达的基因与凋亡相关。这为进一步深入研究METH氧化应激的神经毒性机制提供了方向。