SATB2基因缺失/突变与新生儿原因不明的神经发育障碍之间的关系及分子机制研究

Neurodevelopmental disorder is a great harmful factor threatening newborn health. The difficulty is hard to give a clear diagnosis when exclusing of common chromosomal abnormalities.SATB2 is a highly conserved transcription factor that plays an important role in brain development. Although several mutations of SATB2 have been found in clinical corpus callosum agenesis, mental retardation and other cases, in-depth study is very limited. On the basis of our previous research works, we intended to study the role of Satb2 gene mutations on the brain development. In this study, the deletion/mutations situation of SATB2 in unknown cause of abnormal brain development newborns will be detected in cohort of cases using deep next generation sequencing technology. New mutations of unknown function found in patients will be studied in vitro using HEK293 cell lines and in vivo studies using in utero electroporation, to analysis of the expression, protein location, and the effection on it's related molecular of SATB2 mutants. Meanwhile, by the cooperation with Shanghai Institutes for Biological Sciences of Chinese Academy of Sciences，we will create Satb2 mutants by means of CRISPR/CAS9 target gene knockout technology. Then, using cell biology, genetics,and behavior analysis, to explore changes caused by Satb2 gene mutations in mice brain development, the mechanisms, and possible intervening methods. The purpose of this study is to clarify Satb2 mutant effects on mouse brain development and mechanisms involved, to explore at least part of the reasons of the clinical neonatal neurodevelopmental abnormalities. This study can provide a theoretical basis for early intervention and give evidence of clinical and genetic counseling.

新生儿神经发育障碍发生率高，危害大，在排除了常见染色体异常后，很多病例难以明确诊断。SATB2是一个高度保守的转录因子，在大脑发育中占有重要地位。虽然在胼胝体发育不良、智力障碍患者中已发现SATB2基因的缺失/突变，但缺乏深入研究。我们在前期基础上，研究SATB2基因突变对大脑发育的影响。本课题中，拟通过详细的序列分析，检测SATB2基因在大样本原因未明的脑发育异常新生儿中的突变/缺失情况，并对发现的新的突变进行体外细胞株研究和体内孕鼠大脑胼胝体质粒注射和电转，分析突变体对Satb2的表达、定位和对下游分子的影响。通过与中科院神经所合作，采用CRISPR/CAS9定点基因敲除技术，建立Satb2基因R239X等突变体的小鼠模型，分析不同突变位点对小鼠胚胎大脑发育的影响并进行分子机制研究和干预探讨。通过本研究，可探索部分临床新生儿脑发育异常的原因，为临床早期干预和遗传咨询提供理论依据。

本课题聚焦新生儿神经发育障碍，采用二代测序技术，通过对大样本临床遗传检测的原因未明的脑发育异常婴幼儿数据进行分析（病例纳入标准：原因未明的脑发育异常的小婴儿，伴或不伴其它畸形，如骨骼、颌面部、心脏等发育畸形），整理SATB2 基因突变/缺失情况。在近2000例入组病例中，共发现18例SATB2基因突变/缺失。包括4例2q33.1区域缺失（含一对双胎），3例无义突变，11例错义突变。其中，一例9个月的患儿，因出牙迟就诊，有腭裂手术病史，发育迟缓，检测发现患儿为R239X突变。体外细胞学实验发现，R239X突变体蛋白在HEK293T细胞中的定位不变，仍位于细胞核。免疫共沉淀显示，野生型SATB2蛋白可通过与组蛋白HDAC1结合，募集SKI和MTA2形成NuDR复合物，调控下游转录因子CTIP2的表达；而R239X突变体无法与HDAC1结合形成复合物，但此突变体可直接下调CTIP2的表达，推测突变后的截短蛋白可不通过结合复合物而直接调控下游基因。另外，本课题采用Crisper/Cas9技术，结合该基因在患儿中突变位点的分布，在Satb2基因内含子6-7和8-9之间设计引物，造成约28kb的缺失，定点敲除Satb2基因。结果发现，该敲除小鼠仍然纯合致死，目前仅能获得纯合的胚胎。部分杂合小鼠体型小，找不准奶嘴，活动少，但外观无明显结构异常，无下颌后缩或牙列不齐等，能够成年并生育。针对杂合小鼠的行为学分析结果显示，高架十字迷宫及旷场实验中，与同窝野生型小鼠相比，杂合型小鼠的自发活动、探索能力略差，但差异无统计学意义，无焦虑等情绪障碍。被动躲避实验结果显示，强烈的伤害性刺激后的学习记忆能力没有显著差异。但在新物体识别实验中，SATB2+/-小鼠的相对识别指数明显下降，与SATB2+/+小鼠相比差异有统计学意义，说明SATB2基因敲除杂合型小鼠表现出一定程度的物体识别记忆障碍。针对纯合小鼠胚胎的RNA测序和CHIP Seq数据分析提示多个基因表达下调。这些实验结果为研究SATB2突变对临床新生儿脑发育异常的原因，以及为临床早期干预和遗传咨询提供了理论依据。通过本研究，已发表相关署名SCI论文4篇，培养硕士生1名，在读硕士生1名。