骨髓增生异常综合征向白血病转化的关键功能基因筛选及验证

骨髓增生异常综合征（MDS）一旦转变为急性白血病（转白）治疗效果极差，目前还没有方法早期预测和阻止其转白。迄今为止，MDS转白的机制仍不清楚。已有的研究表明一些基因在MDS转白的过程中表达发生改变，但尚不清楚其中哪些基因起关键作用。我们基于已经建立的MDS患者队列，采用全基因组表达谱分析方法筛选出了MDS转白的相关基因。在此基础上，本研究拟采用实时荧光定量PCR方法对病例组40例和对照组120例患者进行转白相关基因表达量的检测，并将所得的实时荧光定量PCR结果作为一个转白危险因素，结合MDS患者的临床指标和暴露因素，进行MDS转白的危险因素研究，确定MDS转白关键基因。通过在MDS细胞株中干预上述转白关键基因，观察干预前后MDS细胞株生物学特性的改变，进一步验证MDS转白关键基因的功能。所得结论为找到早期预测MDS转白的基因标志提供科学依据，同时也为MDS的靶向治疗奠定理论基础。

在课题组435例MDS患者巢式病例对照研究队列基础上，我们首次采用临床流行病学和全基因组表达谱芯片相结合的方法，经芯片自身对照研究和转白危险因素配对的芯片病例对照研究，通过生物信息学分析，筛选出6条MDS转白候选相关基因。这6条基因按差异显著程度依次为TUBB、PSMD1、SLC7A5、ATG3、TUBB2C和TIMM10。我们对ATG3、TUBB、PSMD1、SLC7A5基因进行了初步功能研究。查阅文献后我们发现，上述6条基因均与实体肿瘤的发生和发展相关。但到目前为止,尚未见到上述6条基因表达异常与MDS转白的相关研究。其中引人注目的是，上述6条基因中仅有ATG3一条基因是下调的。ATG3 基因，即自噬体相关基因3，编码自噬体相关蛋白3，参与自噬体的形成。自噬是细胞内物质代谢的重要途径。现在普遍认为自噬对于肿瘤的发生发展起促进和抑制双重作用，在某些情况下可以相互转化。因此，我们首先在MDS转白细胞系SKM-1中对ATG3基因进行了相关研究。我们采用携带ATG3质粒的慢病毒载体，感染SKM-1细胞使其过表达ATG3，观察并比较ATG3过表达前后SKM-1细胞系的生物学特性改变。结果发现，过表达ATG3基因的SKM-1细胞系增殖能力明显受到抑制，细胞活力显著降低，并可以促使SKM-1细胞从早期凋亡进入晚期凋亡和死亡。提示ATG3基因表达下降可能通过影响MDS恶性克隆的增殖途径在MDS转白过程中起作用。对于表达上调的MDS转白候选相关基因，我们采用siRNA方法在SKM-1细胞系中分别沉默TUBB、PSMD1、SLC7A5基因后，发现SKM-1细胞均不同程度增殖受抑，S期细胞比例明显减少，软琼脂克隆形成能力下降，提示TUBB、PSMD1和SLC7A5表达上调可能是促进MDS患者骨髓恶性克隆细胞增殖的重要因素，这些基因表达异常在MDS疾病进展过程中的作用值得进一步深入研究。在完成上述工作基础上，我们还通过较大剂量间断冲击诱导法成功建立了耐HHT 17.95倍的人SKM-1细胞系SKM-1/HHT，生物学特性研究结果显示，SKM-1/HHT细胞系除对化疗药物耐药性较亲本细胞系SKM-1增高外，两者在形态学、免疫标志、细胞遗传学、裸鼠致瘤性等生物学行为基本一致。SKM-1/HHT细胞系的建立为今后研究继发于MDS的急性髓系白血病患者广泛存在的多药耐药现象提供了一个实验平台。