Bacillus sp. CX-1砷甲基化的分子机制研究

Microbial arsenic (As) methylation is an important component of the As biogeochemical cycle. Microbial methylation transforms the chemical species of As and its toxicity in the environment. Understanding the mechanism of microbial As methylation is therefore of great environmental importance. Until now, arsenite S-adenosylmethionine methyltransferase (ArsM) is found to be the only class of enzymes involved in microbial As methylation. It has been reported that all ArsMs studied to date contain four conserved cysteine residues, which are essential for the methylation activity. Recently, we have identified an ArsM homologous protein (BlArsM) from a Bacillus strain named CX-1. Interestingly, BlArsM has only three conserved cysteine residues, but still has the activity of As(III) methylation. In this proposal, we will investigate the detoxification and catalytic mechanism of BlArsM to verify if BlArsM represents a new type of ArsM. Furthermore, our preliminary work showed that there must exist another unknown As(III) methyltransferase in this bacterium. In this proposal, we will identify the unknown As(III) methyltransferase and investigate its mechanism of As methylation. The research proposed in the project will aim to elucidate the molecular mechanisms of As methylation by Bacillus sp. CX-1.

微生物介导的砷甲基化是砷生物地球化学循环的重要组成部分，对环境中砷的形态转化及毒性产生重要影响，因而研究其发生的机制具有重要的环境意义。目前，微生物体内仅发现了一类催化砷甲基化的酶，名为As(III)-S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶（ArsM）。已报道的ArsMs都有四个保守的半胱氨酸位点（Cys），它们的存在被认为是ArsMs发挥活性的一个必要条件。有趣的是，申请人近期在菌株Bacillus sp. CX-1中鉴定到一个ArsM的同源蛋白（BlArsM），仅有三个保守的Cys，但仍有甲基化As(III)的能力。本项目中，我们将进一步阐明BlArsM对于As(III)的解毒作用及催化机制，以验证它是否是一个新型的ArsM。此外，前期的研究结果表明，菌株CX-1中应该还存在另外一个未知的As(III)甲基转移酶，本项目将继续寻找这个未知的酶并研究其作用机制，以期深入解析菌株砷甲基化的分子机制。

微生物介导的砷甲基化过程是砷生物地球化学循环的重要组成部分，其对环境中砷的毒性与迁移性都会产生重要影响。催化微生物砷甲基化的是一类名为三价砷【As(III)】S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶（ArsM）的酶类。以往发现的ArsMs序列中都含有四个保守的半胱氨酸（Cys）残基，它们的存在被认为是酶发挥活性的一个前提条件。我们前期在As(III)甲基化菌株Bacillus sp. CX-1的基因组中鉴定到一个ArsM同源蛋白编码基因BlarsM，其编码产物BlArsM的序列中仅含有三个保守的Cys（Cys10、Cys145和Cys195）。异源表达BlarsM可以赋予As(III)超敏感大肠杆菌AW3110更高的As(III)抗性，并可赋予转基因菌株甲基化As(III)的能力；纯化的BlArsM可以在体外甲基化As(III)和三价单甲基砷【MAs(III)】，生成终产物五价二甲基砷【DMAs(V)】；将BlArsM序列中所有的保守与非保守的Cys（Cys11、Cys193和Cys268）分别突变为丝氨酸（Ser），获得的突变蛋白中仅C145S和C195S丧失了甲基化As(III)和MAs(III)的活性，四Cys突变蛋白C10S/C11S/C193S/C268S仍具有甲基化的活性；以上结果表明，BlArsM是一个仅依赖两个保守Cys即可发挥活性的新型ArsM。敲除BlarsM的突变菌株Bacillus sp. CX-1(△BlarsM)仍具有甲基化As(III)的能力，但其甲基化的终产物为五价单甲基砷【MAs(V)】，而非DMAs(V)；对菌株CX-1的基因组进行分析，发现BlarsM与下游砷操纵子阻抑蛋白编码基因arsR之间相隔7个假定基因，其中包括一个名为rSAM的基因，其编码一种钴胺素（B12）依赖型一甲基转移酶；在突变菌株CX-1(△BlarsM)中敲除rSAM基因会使双基因敲除突变株CX-1(△BlarsM△rSAM）完全丧失甲基化As(III)的能力，而回补rSAM会使双基因敲除突变株恢复As(III)的一甲基化能力；以上结果说明，rSAM 编码一种有别于ArsM的新型As(III)一甲基转移酶。综上，本项目深入解析了菌株Bacillus sp. CX-1砷甲基化的分子机制。