非长期存活依赖型PGPR菌株Bacillus sp. WP8促生机制研究

过去人们认为，植物根际促生菌(PGPR)发挥作用的前提是在土壤中能较长时间存活，然而，许多PGPR在野外环境中存活时间短且不稳定的事实，成为制约PGPR实际应用的主要障碍和顾虑。我们的前期研究工作表明，Bacillus sp. WP8在土壤中的行为特征有别于传统认识，通过分析我们提出："WP8通过调控土壤土著微生物群落对豇豆进行促生"这一假说。本项目基于接种WP8，待改变土著微生物群落后再进行种植比较的思路，以不同肥力土壤和不同植物环境下，接种WP8对土著微生物群落的影响为重点，研究土著微生物群落的变化与促生效应的关系，验证WP8的促生机制；以两种不同促生机制的PGPR菌株WP8和RA6为代表，比较并揭示WP8的作用特点。通过本研究，有望丰富PGPR的促生机制，拓展PGPR的筛选思路和应用策略，同时为WP8的进一步开发利用提供理论依据。

植物根际促生菌（PGPR）的促生/生防机理是农业微生物学的研究热点。本项目的研究假设是，PGPR调控土著微生物群落是其促生机制之一。为此，我们采取连续盆栽实验，运用PCR-DGGE方法比较并分析了Bacillus pumilus WP8和另一PGPR菌株Pseudomonas chlororaphis RA6对土著细菌群落结构的影响，并解析了其和PGPR促生持续时间之间的关系。研究发现，WP8在土壤中的存活时间少于40 d（低于DGGE检测限），但土壤细菌群落特别是优势菌群随时间发生了显著变化，这种变化使得土壤对植物产生至少90 d持续的促生作用（与CK相比）。RA6虽然能在土壤中存活至少60 d（小于90 d），但对土著细菌群落结构的影响较小，且随着RA6在土壤中的消亡，其对植物的促生作用也随之消失。土壤酶活性结果显示，WP8能显著促进土壤过氧化氢酶活性，暗示其能刺激土壤微生物活性，可能是其调控土壤优势种群的因素之一。实验证明了WP8对土著微生物的调控可能是其促生机制之一。在菌株配伍促生实验中，我们偶然发现两株PGPR菌株，WP8和Erwinia persicinus RA2，虽在体外具有很好的相容性，但混合使用时却未表现出预期的促生/生防能力。进一步研究发现RA2能抑制WP8的生物膜形成，并导致促生/生防功能丧失，采用LC-MS/MS技术，我们鉴定出了RA2初级代谢产物中的D-谷氨酰胺能显著抑制WP8生物膜的形成，而RA2次级代谢液中的茉莉酸和多糖物质有助于缓解抑制效应，该研究表明在PGPR混合使用时，需关注菌株之间生物膜的相互抑制对配伍效果的影响。另外，我们研究证实了WP8能促进番茄耐盐生长，而产ACC脱氨酶并非是促进植物耐盐生长的唯一因素。我们还发现WP8对番茄青枯病的生防作用并非通过抑制其生长，而是弱化了其致病力，相关工作尚在进行中。此外，为从功能基因组学的角度进一步探究WP8的促生/生防机制，我们还对WP8进行了全基因组测序。通过构建WP8基因组BAC文库，找出了疑似WP8对环境耐受性及促生的相关基因，这有助于进一步解析WP8促生/生防具有广适性的分子机理。总之，我们圆满并超额完成了项目既定的研究目标和任务，相关内容发表论文12篇，SCI收录5篇，EI收录1篇，部分工作投稿2篇，同时为后续深入研究奠定了工作基础。