控制释放生长因子型智能水凝胶的制备及其应用研究

Cell,scaffold and growth factor are three key factors in tissue engineering.We used saccharifying PNIPAAm and sulfated polyglutamic acid to prepare intelligent hydrogel scaffolds,and culture embryonic stem cells or induced potential stem cells on it.Somatic stem cells used as co-cultured system to induce ES/IPS cells differentiation to liver cells.We foucs on one is the control release effects of growth factors from scaffolds.Second is the nutritional paracrine effects of the somatic stem cells .Third is scaffolds influence on ES/IPS cells differnentiation to liver cells and its application in bio-artificial liver.

细胞、支架和生长因子是组织工程所必须的三个关键因子。本项目以ES/IPS细胞为种子细胞，以糖化PNIPAAm和72%侧链硫酸化的聚谷氨酸生物大分子构建具有稳定并调控生长因子释放作用的智能凝胶载体，以成体干细胞共培养方式构建ES/IPS细胞向肝细胞分化的微环境。主要研究：1.载体对生长因子的控制释放作用；2.成体干细胞的营养性旁分泌作用及载体对生长因子的动态调控；3.载体对ES/IPS细胞向肝细胞分化行为的影响及在生物人工肝应用中的初步研究。基于制备智能凝胶技术研究平台，进一步制备具有生长因子调控作用的新型干细胞培养载体，并探讨其在生物人工肝中的应用研究。

聚（N-异丙基丙基酰胺）（PNIPAAm）是一种温度敏感型水凝胶，具有低临界溶解温度LCST（32℃左右），可以替代酶类物质收获贴壁型细胞，但是其生物相容性欠佳。因此，本项目以PNIPAAm和γ-PGA-S72为单体通过半互穿方式制备了一系列PNIPAAm/γ-PGA-S72半互穿温敏水凝胶，提高了其生物相容性，随后并对该半互穿水凝胶作为细胞载体和生长因子释放载体进行了研究。γ-聚谷氨酸（γ-PGA）和牛磺酸在EDC•HCl的活化作用下制备了磺酸化的γ-PGA（γ-PGA-S72），并利用红外光谱和核磁氢谱证明牛磺酸上的氨基和γ-PGA侧链上的羧基发生了酰胺化反应。研究表明，γ-PGA-S72在酸性、热处理和胰蛋白酶条件下具有明显保护bFGF生物活性的作用。在N，N’-亚甲基双丙烯酰胺（MBAA）交联剂的作用下，将线性γ-PGA-S72聚合物加入到PNIPAAm网络中制得PNIPAAm/γ-PGA-S72半互穿水凝胶。通过环境扫描电子显微镜和差示扫描量热法分别对该水凝胶形态及热力学性能进行了表征，并通过溶胀性能测试表明该水凝胶具有良好的温度和pH敏感性。通过体外细胞培养，考察了NIH-3T3细胞在半互穿水凝胶表面的生长情况，显微镜观察和MTT测试结果表明，NIH-3T3细胞能够在半互穿水凝胶表面紧密粘附、充分伸展，细胞数量随培养时间的延长而逐渐增多，和PNIPAAm水凝胶相比，半互穿水凝胶表面细胞表现出更好的增殖活性，表明γ-PGA-S72的引入提高了水凝胶的生物相容性。此外，将温度降低至该水凝胶LCST以下，细胞可以自发的从温敏水凝胶表面脱附，与胰酶消化脱附相比，细胞损伤更小，并且脱附后的细胞增殖活力更高。通过渗透-吸附法制备了负载碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的半互穿水凝胶，采用ELISA方法对bFGF的负载率和释放率进行了研究，表明负载bFGF的semi-IPN08水凝胶在相同时间点比PNIPAAm水凝胶表现出更快的吸附速率、更大的吸附量和相对缓慢的释放速率。体外细胞培养发现，负载bFGF的水凝胶具有良好的细胞相容性，并且从水凝胶中释放出的bFGF仍保持其生物活性。本项目采用半互穿方式制备了PNIPAAm/γ-PGA-S72半互穿温敏水凝胶，可以作为细胞增殖及活性物质释放载体，为生物医学领域提供了一种性能优良的新材料，具有广阔的应用前景。