HNF1α与14-3-3ξ相互作用的分子机制及其生物学意义研究

HNF1α是维系肝脏正常分化表型及生理功能的重要转录因子，募集多种辅助因子协同作用精密调控调控肝脏特异基因的时空特异性表达。14-3-3ξ通过识别磷酸化的丝/苏氨酸位点而与多种蛋白质结合进而参与多个生物学过程。前期研究表明HNF1α与14-3-3ξ在体内存在相互作用且14-3-3ξ可增强HNF1α的转录活性。我们推测：14-3-3ξ可能通过识别并结合磷酸化的HNF1α增强这些HNF1α的转录活性，使HNF1α选择性的增强对某些靶基因的转录。本研究拟通过对HNF1α与14-3-3ξ相互作用位点、影响因素、14-3-3ξ对HNF1α的调控作用、相互作用的分子机制等问题进行研究，从而揭示14-3-3ξ与HNF1α相互作用在基因选择性表达调控中的意义。两者相互作用分子机制的研究对阐明HNF1α的调控及在肝脏发育与分化中的作用具有重要的指导意义。

14-3-3 通过与不同蛋白质相互作用而参与包括信号转导、转录调控、物质转运、离子通道调节、细胞凋亡、周期调控以及细胞恶性表型在内的各种生物学过程。前期，我们采用免疫共沉淀级联质谱策略发现14-3-3ξ 是HNF1α 的另外一个新相互作用候选分子。在本项目中，我们利用免疫共沉淀实验证明14-3-3ξ与 HNF1α存在蛋白质相互作用；GST-pull down 实验进一步证明14-3-3ξ 与HNF1α 存在相互作用；荧光素酶报道基因实验证明14-3-3ξ 增强HNF1α 依赖的转录活性；染色体免疫共沉淀实验和EMSA 实验证明14-3-3ξ被HNF1α 募集到其靶基因的启动子区并增强其DNA 结合能力；RNAi 下调内源性的14-3-3ξ，HNF1α 的部分下游靶基因的mRNA 表达下降，而部分靶基因的mRNA 表达没有改变，提示14-3-3ξ 可能是HNF1α的重要调控分子，并在HNF1α 靶基因的选择性表达中发挥重要的调控作用。生物信息学分析显示，HNF1α 的S247 和S303 是潜在的14-3-3 识别位点，我们通过质谱鉴定证明HNF1αS247的磷酸化，点突变实验表明S247的磷酸化修饰对HNF1α的转录活性至关重要。此外，我们还证实HNF1α与14-3-3的相互作用依赖S247的磷酸化。综上所述，14-3-3/HNF1α 的相互作用可能具有重要的生理意义，并可能在肝脏、胰腺等疾病的发生、发展中起作用。