拟人化hERG基因突变及敲除的糖尿病动物模型的建立

Anthropomorphic animal models of diabetes are necessary for the research of pathogenesis and new pharmaceutical targets of diabetes. There are obvious differences between spontaneous diabetic animal models and human single gene or polygenic diabetes. Previously, we found that a missense mutation of hERG gene is the cause of a special diabetes in a large pedigree; hERG potassium channels and KATP potassium channels play a complementary role on pancreatic β cells release of insulin; blocking hERG can promote insulin secretion. This study will build anthropomorphic diabetic animal models with hERG gene mutation. We will apply CRISPR-Cas9 and TALEN knockout / modification technology to build hERG gene knockout and targeted modification/point mutations in the rats and zebrafish; use mice models of gene knockout and targeted modification in hERG gene to study its effects and its mechanisms on insulin release; use zebrafish models of gene knockout in hERG gene to study its mechanism on islet development and to be used for high- throughput screening of diabetic drugs. The model will help understanding of the mechanism of insulin secretion occurring in human diabetes, and exploring new treatment for diabetes.

真实模拟人类糖尿病动物模型是糖尿病发病机制及药物新靶点研究的必要条件。目前的自发性糖尿病动物模型与人类的单基因及多基因遗传糖尿病存在明显差异。前期研究我们发现，hERG基因的错义突变是一个特殊大型家系发生糖尿病的原因；而hERG钾通道与KATP钾通道对胰岛β细胞释放胰岛素发挥互补性调节作用；阻断hERG可促进胰岛素分泌。本课题将构建拟人化hERG基因突变糖尿病动物模型。分别应用CRISPR-Cas9和TALEN基因敲除/修饰技术在大鼠和斑马鱼两种动物中构建hERG基因敲除和点突变靶向修饰糖尿病模型。用构建的大鼠基因敲除和靶向修饰模型研究hERG钾通道对β细胞释放胰岛素的影响及其作用机制。用构建的斑马鱼基因敲除模型研究hERG基因缺乏后对胰岛发育的影响及未来用于高通量筛选针对hERG钾通道的药物。该模型的构建将有助于深入了解人类胰岛素分泌的机制与糖尿病的发生，探索糖尿病新的治疗方法。

对项目名称的重要说明：hERG2的通用基因名为KCNH6。.1、本课题组采用TALEN技术构建了KCNH6（hERG2）基因敲除（KO）老鼠动物模型，发现其存在糖耐量异常，胰岛素分泌降低和胰岛素抵抗等表型。同时课题组还采用CRISPR/Cas9技术构建了KCNH6点突变小鼠（KI）动物模型，同样存在糖耐量异常等表型。两个模型的胰岛功能受损，胰岛β细胞数量降低，钙中毒等问题。机制方面，HEK293细胞系和原代胰岛细胞上进行膜片钳实验发现基因敲除动物WT组存在Kv电流，且电流幅度较大，KO组与KI组的KV电流幅度及密度明显下降，说明KCNH6敲除或发生突变后，胰岛B细胞上钾通道电流显著减少。胰岛β细胞动作电位也发生变化，KCNH6敲除或者突变，会使β细胞复极化时间延长，而复极化的幅度并无显著差异。KCNH6钾通道的功能障碍导致高胰岛素血症和新生儿低血糖表型；但成年期逐渐出现胰岛功能衰竭，最终出现低胰岛素血症和糖尿病的表型。KCNH6功能障碍，使细胞内钙水平增加，短期来看导致高胰岛素血症。但细胞内钙的慢性升高，导致β细胞的钙应激，过度胰岛素分泌及细胞凋亡，从长期来看导致低胰岛素血症。以上内容的主要工作已经发表在 2018年12月26日出版Cell Reports期刊上。..2、课题组采用CRISPR/Cas9技术构建了rfx6基因敲除斑马鱼动物模型，该动物模型存在糖耐量异常、生长缓慢和生存率低等问题。进一步研究发现其存在血糖升高和胰岛结构疏松，除β细胞外，其余细胞均消失。分子生物学实验显示胰岛素蛋白水平降低但是转录水平正常。转录组分子表达谱(RNA-seq)结果显示，rfx6基因与胰岛发育和胰岛素翻译的调控相关。染色质免疫共沉淀技术(Chip)结果显示rfx6基因与胰岛素翻译起始位点eif2a和eif5的启动子和增强子区域结合。说明rfx6是不仅对胰岛发育，对胰岛素翻译同样起重要调控作用。..3、一项病例对照研究和5.3年前瞻性队列研究探索威胁视力的增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）的特异性尿蛋白是否是预测T2D患者慢性肾功能不全（CRI）的指标。结果表明，尿触珠蛋白是一种新的生物标志物，可作为尿微量白蛋白的补充，预测T2DM患者的肾损害。