通过建立小鼠Spanxn基因敲除动物模型研究其在精子发生中的功能

The mouse Spanxn gene is located on the X chromosome and specifically expressed in testis. The homologous Spanxn gene in human is a SPANX gene family, which contains two subfamilies SPANX-A/D and SPANX-N. Human SPANX gene family is post-meiotic expressed and is thought to be involved in the formation of acrosome and sperm nucleus. In our previous study on Globozoospermia patient's sperm with homozygous mutation of PICK1 gene, we found that the expression of several SPANX proteins were significantly reduced in patients' sperm compare to that in normal sperm. Moreover,the expression of SPANX proteins was also significantly reduced in the donors'sperm with low fertility(no pregnancy in 12 AID treantment cycles). However, the precise biological function of the SPANX gene family remains unclear. In this project, we intend to use mice as a model since mice have a single form of SPANX, which will simplify the study of SPANX function. We will study the time and spacial expression pattern of Spanxn during mouse development. We will also establish a Spanxn knockout mice model and implement whole genome expression profiling and proteome analysis to uncover Spanxn function. Combining all the data above and with the use of bioinforatics, we intend to elucidate the molecular mechanisim and regulatory network of Spanxn.This project will establish a Spanxn-/- knockout male infertility animal model.It is meaningful to reveal the mechanism of SPANX gene family in spermatogenesis, especially in spermiogenesis stage. It will also provide a theoretical basis and guidance for the clinical treatment of male infertility and may help us to find candidate targets for male contraceptive drugs and new contraceptive approach.

小鼠的Spanxn基因定位于X染色体，在睾丸组织中特异性表达。人类的同源基因家族SPANX在减数分裂之后表达，推测与精子核和顶体的形成相关。前期研究显示，在PICK1基因纯合突变导致的圆头精子中有多种SPANX蛋白的表达显著下调；在低生育能力的供精者精子中，也发现有多种SPANX蛋白表达下调，但SPANX基因确切的功能尚有待证实。本课题拟通过研究小鼠spanxn基因时空表达模式、基因敲除后的表型改变来初步阐明其生理功能；通过基因敲除后基因表达谱和蛋白质组学改变的比较，结合生物信息学分析，探讨其分子调控的网络和机制。本课题不仅将创建出新的男性不育动物模型，也将初步揭示SPANX基因家族在精子发生过程中，特别是精子变形过程中的作用和机制，其结果将为临床上男性不育的诊断、治疗和预防提供理论依据与指导，为新的男性避孕药物和新的避孕途径研究提供候选靶标，将有力地推进男性生殖健康。

本课题组依托差异蛋白质组学技术平台，着重研究不同精子结构、功能状态下的蛋白质组学改变。从PICK1基因纯合突变导致的圆头精子症患者的精子样本中，我们采用差异蛋白质组学分析（DIGE-MS）找到了35个与正常精子相比有显著表达差异的蛋白质，从而发现SPANX 蛋白家族。我们以精液参数正常(达到或超过卫生部供精者标准)但生育能力不同的人类精子库供精者精子样本进行差异蛋白质组学分析，发现与高生育能力的精子样本(10个或10个以内人工授精治疗周期完成了5例妊娠，周期临床妊娠率≥50%)相比有32个蛋白质在低生育能力精子样本(完成12周期人工授精治疗，每周期为不同的女性受者，她们经临床检查后认为符合治疗条件，但没有1例妊娠，周期临床妊娠率：0% )中表达下调，9个蛋白质表达上调。在表达下调的蛋白质中包含了SPANX-a/d亚家族的全部成员，SPANX-a1，-a2，-b，-c，和-d。鉴于常规分析正常的精子其隐性异常可能主要与精子的获能和顶体反应有关，结合前述SPANX蛋白的表达特征和在圆头精子中的表达改变，我们推测SPANX蛋白的功能可能与精子核和顶体的形成相关，继而影响了精子的受精能力。进一步的Western Blotting验证分析证明，SPANX确实与男性精子的生育能力显著相关。所示，SPANX蛋白在AID周期临床妊娠率≥50%的精子样本中的表达量要显著高于低生育能力精子样本中的表达量，据此，我们初步证明SPANX确实是生育能力相关分子，根据科技查新，这也是首次证实SPANX基因与生育能力相关。.由于SPANX在人类中较为复杂，而其在小鼠中的同源基因Spanxn只有一个拷贝，是研究该基因功能的理想材料。我们与华中师范大学上海市调控生物学实验室合作，利用CRISP/Cas9技术对小鼠中该基因进行敲除，目前刚出生8只Founder小鼠，等待鉴定。.综上所述，我们在过去的一年里，利用Western Blotting技术首先证实了SPANX与人类精子生育能力相关，目前初步获得首建小鼠以及获得国家实用新型专利一项。由于该基因家族比较复杂，而敲除小鼠构建较为耗时，需要进一步完善数据发表高水平论文。