DSN酶介导的胰腺癌早期诊断多联cmiRNA标志物直接检测的实验研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma is one of the most serious carcinomas and early detection is the only way to improve the prognosis. Previous researches showed that the panels of circulating microRNA (cmiRNA) could be taken as valuable biomarkers for early detection of pancreatic cancer. However, no unanimous miRNA panel have been established. Besides, the PCR-based methodologies is unsuitable for microRNA detection because the short sequence of 22nt making the design of PCR primer extremely difficult. Our preliminary studies indicate that quantum dots self-assembly can amplify the fluorescence signals exponentially so as to detect the DNA molecules without nucleic acid amplification. But the sensitivity and specificity are relatively low in RNA detection. In this project, we would like to propose an assay for miRNA detection by using molecular beacon (MB) to ensure the high-specific capture of the miRNA molecules, using carbon dots with high fluorescence and low toxicity to be the donor chromophore and the Black Hole Quencher (BHQ) series stain be the quencher to label the MB probe, by which the fluorescence signal could be measured once the ring is open. Duplex-specific nuclease (DSN) was employed to cleave the DNA within the DNA-RNA hybrid, after which the target miRNA could be released to re-hybridize with the remaining MB probe to initiate the “hybridization-cleavage” cycle, and the fluorescence of carbon dots could be amplified after accumulation. Finally we will establish an approach for multiplex miRNA detection, which could provide a technique support for early pancreatic cancer detection. Moreover, this would provide a fundamental for elucidating the mechanism of RNA regulation in pancreatic cancer oncogenesis.

胰腺癌恶性程度高且预后极差，早期诊断是提高其生存率前提。研究表明多联循环microRNA（cmiRNA）组合作为无创检测标志物可提高胰腺癌早期诊断准确度，但其检出效率受人群差异影响较大。且cmiRNA序列短，引物设计困难是限制PCR类技术用于其多重联检的瓶颈。项目组前期研究发现量子点自组装技术可实现DNA无扩增直接检测，但尚无法直接检测RNA。本项目拟筛选并验证一组适合我国人群的高特异多联cmiRNA标志物，再以多色分子信标(MB)探针增强cmiRNA高特异识别和捕获；以高荧光性能、低毒的多色碳量子点与BHQ系列染料共同标记MB探针实现多重荧光信号的“开/关”控制；以双链特异性核酸酶（DSN）选择性酶切DNA-RNA双链中的DNA探针，释放靶分子并启动“杂交-酶切”循环过程，使荧光信号放大而解决灵敏度问题。最终建立多联cmiRNA无扩增直接检测技术，为早期诊断胰腺癌并改善其预后提供技术支撑

胰腺癌恶性程度高且预后极差，早期诊断是提高其生存率前提。研究表明多联循环microRNA（cmiRNA）组合作为无创检测标志物可提高胰腺癌早期诊断准确度，但其检出效率受人群差异影响较大。且cmiRNA序列短，引物设计困难是限制PCR类技术用于其多重联检的瓶颈。项目组前期研究发现量子点自组装技术可实现DNA无扩增直接检测，但尚无法直接检测RNA。基于此本项目展开基于DSN酶与碳量子点（DSN-CDs）的荧光信号放大系统技术直接检测多联cmiRNA的研究。本项目在研究过程中，严格按照预定计划进行实验，通过4年的实验研究，已完成了所有预定研究目标：构建碳量子点纳米颗粒合成、表征、表面功能化的技术平台，优化了分子信标探针与碳量子点偶联的条件，建立了基于DSN酶与碳量子点（DSN-CDs）的荧光信号放大系统。通过方法学评价，探讨了该方法用于miRNA检测的灵敏度、特异性、检测速度，并且与现有的方法学进行了比对以证明其有效性。同时基于DSN酶循环酶切信号放大策略，建立了基于DSN酶整合纸基石墨烯阵列芯片的核酸检测技术，为cmiRNA检测提供新的技术支持。在此基础上，进一步研究了纳米材料理化属性对于不同层面生物分子的生物学效应展开研究，因此，结合课题开展的实际需要，本项目适当增加了部分研究内容以进行纳米材料的体外毒性研究和对微生物杀伤效应研究，先后建立了三重功能纳米材料TRIDENT协同根除多药耐药细菌，并阐明了纳米材料对于病原微生物细胞的破坏机制，从而为进一步进行基于纳米材料的生物学应用研究奠定了坚实的实验基础。进一步探索了液体活检新技术的开发与应用，为疾病的早期诊断提供支持。.本课题历时4年，共发表标注有基金号的文章11篇，其中SCI论文8篇，IF>10分 4篇，IF>5分 2 篇。本课题共申请发明专利5件，其中3件获得了国家发明专利授权。本项目的顺利实施为后续基于纳米材料的生物应用研究奠定了坚实的理论和实验基础，对于研发相应的检验设备具有重要意义，为拓展纳米生物传感技术的在体应用奠定了基础。