基于量子点LBL-SA的荧光信号级联放大技术用于多重耐药MTB直接检测的实验研究

Rapid determination of multiple-drug resistant MTB plays important roles in personalized therapy of tuboluclosis. However, conventional PCR based methods are restricted by the inhibition of low concentration template during amplification procedure. This research aims to establish a LBL-SA signal amplifciation method with the mediation of biotin-avidin combination, which can be used to detect multiple-drug resistant MTB without amplification. Two specific MTB probes (P1/P2) are designed and labelled with quantum dots and iron oxide, respcetiviely, to eliminate the interference from proteins in serum. PNA in place of DNA probe is used to ensue any low concentration target can be captured by the probes and mutiple-color PNA mutation probes (P3) are designed to detect any genetic mutation of the MTB. Later, mathmatic models are established to similate the fluorescence signal amplification and reveal the mechanism of fluorescence amplification. The research can not only directly and rapidly detect MTB genetic mutation at once, but also can establish a novel signal amplification method without any target molecular amplification, which is of great importance in medical and biological sciences.

快速分析结核分枝杆菌（MTB）的耐药特征对于结核病的个体化治疗具有重要意义。然而现有技术均无法实现MTB的无扩增直接检测。受纳米材料自组装技术的启发，我们认为量子点自组装可实现荧光信号的级联放大。本项目拟在前期建立的磁聚荧光双杂交技术基础上，通过亲和素介导的量子点的层层自组装（LBL-SA）建立新型荧光信号级联放大技术，实现MTB分子的无扩增直接检测。本课题拟以肽核酸（PNA）替代DNA探针确保痕量靶分子的高效识别与捕获；通过超顺磁颗粒标记MTB种属特异性探针用以高特异富集MTB分子，消除背景干扰；以量子点的LBL-SA实现荧光信号的级联放大；以多色量子点标记的PNA突变探针实现多个MTB耐药基因突变的同步检测。进一步通过构建荧光信号放大数学模型，阐明量子点自组装的荧光放大规律。最终创建一种全新的荧光信号放大技术，实现多重耐药MTB的直接检测，以期为深入研究结核分枝杆菌耐药机制奠定基础。

快速确定结核分枝杆菌（MTB）的耐药性对于制定合理的结核病个体化治疗方案具有重要意义。然而现有分子生物学检测技术均无法实现结核分枝杆菌耐药突变的无扩增直接检测。基于此本项目在前期建立的磁聚荧光双探针杂交平台基础上，展开基于量子点LBL-SA的荧光信号级联放大技术直接检测多重耐药MTB的研究。本项目在研究过程中，严格按照预定计划进行实验，通过4年的实验研究，已完成了所有预定研究目标：建立了量子点纳米颗粒合成、表征、表面功能化的技术平台，合成了多色量子点纳米颗粒并完成其表面功能化和层层自组装，最终建立了基于量子点层层自组装的荧光信号放大系统。通过方法学评价，探讨了该方法用于MTB检测的灵敏度、特异性、检测速度，并且与现有的方法学进行了比对以证明其有效性。在此基础上，进一步研究了纳米材料理化属性对于不同层面生物分子的生物学效应和体内外毒性，因此，结合课题开展的实际需要，本项目适当增加了部分研究内容以进行纳米材料的体外毒性研究和对微生物杀伤效应研究，先后建立了基于三维微组织的纳米材料细胞毒性检测技术平台，并阐明了纳米材料对于病原微生物细胞的破坏机制，从而为进一步进行基于纳米材料的生物学应用研究奠定了坚实的实验基础。. 本课题历时4年，共发表标注有基金号的文章12篇，其中SCI论文9篇，IF>10分 4篇，IF>5分 1 篇。部分研究成果获得第二届全军生物医学技术--军事医学转化与保障提升大会优秀论文、2014美国临床生化年会最佳摘要奖、2014美国临床化学年会学生旅行奖等奖项3项。本课题共申请发明专利7件，其中申请3件美、英、澳国际PCT专利，3件获得了国家发明专利授权。本项目的部分成果以述评形式发表于J Am Chem Soc (2016;138:2064)。并被J Am Chem Soc执行编辑列为重点推荐（2016;138:2455）。JACS主编认为该文是“It deals with an exciting and promising field of research!”本项目的顺利实施为后续基于量子点等纳米材料的生物应用研究奠定了坚实的理论和实验基础，对于研发相应的检验设备具有重要意义，为拓展纳米生物传感技术的在体应用奠定了基础。