基于石墨烯协同DSN酶的肺癌clncRNA超敏检测的实验研究

Lung cancer is one of the most serious carcinomas and early detection is the only way to improve the prognosis, studies have shown that circulating lncRNA (clncRNA) can increase the accuracy of early diagnosis and prognosis of clinical Lung cancer patients as a noninvasive biomarker. However, the efficacy of clncRNA detection was largely influenced by its content and non-amplification detection of trace clncRNA is unrealistic based on current molecular biology detection technologies. Previous research of this project group have found that direct non-amplification detection of microRNA can be realized by duplex-specific nuclease nuclease (DSN) amplification technology but the sensitivity was not enough to directly detect clncRNA.This project plans to adopt peptide nucleic acid-specific (PNA) probe in place of conventional single-strand DNA probe to ensure the single-base mismatch and hypersensitive capture of trace target molecule; then graphene-constructed clustered-array electrode was used to ensure single lncRNA to be captured by PNA probe; DNA probe from DNA-RNA double strands was digested using DSN selective enzyme, releasing the target molecule and launching the circulation process of hybridization and enzyme digestion, which lead to the cascading amplification of electro-chemical signal. Therefore, non-amplification detection of trace clncRNA is realized, providing technical support for early lung cancer diagnosis and treatment.

肺癌恶性程度高且预后极差，早期诊断是提高其生存率的前提，研究表明循环长链非编码RNA（clncRNA）作为无创检测标志物可提高临床肺癌早期诊断及预后判断的准确度，但clncRNA检出效率受其含量影响较大，常规的检测技术无法实现痕量clncRNA的无扩增检测。项目组前期研究发现双链特异性核酸酶（DSN）信号放大技术可实现microRNA无扩增直接检测，但其灵敏度尚无法直接检测clncRNA。本项目拟以肽核酸（PNA）特异性探针替代传统的单链DNA探针确保痕量靶分子单碱基错配识别和超敏识别与捕获；再以石墨烯构建簇从阵列式电极，通过簇从阵列式石墨烯电极确保单个lncRNA被PNA探针群捕获；以DSN选择性酶切DNA-RNA双链中的DNA探针，释放靶分子并启动“杂交-酶切”循环过程，使电化学信号级联放大，最终实现痕量clncRNA的无扩增检测，以期为早期诊断肺癌并改善其预后提供技术支撑。

肺癌恶性程度高且预后极差，早期诊断是提高其生存率的前提。研究表明非编码RNA（ncRNA）作为无创检测标志物可提高临床肺癌早期诊断及预后判断的准确度，但ncRNA检出效率受其含量影响较大，常规的检测技术无法实现痕量ncRNA的无扩增检测。项目组前期研究发现双链特异性核酸酶（DSN）信号放大技术可实现miRNA无扩增直接检测，但受限于检测芯片传感器稳定性，无法实现临床血浆样本中核酸分子的准确检出。基于此本项目展开基于纸基石墨烯阵列芯片结合DSN酶信号放大系统技术直接检测多重miRNA的研究。本项目在研究过程中，按照预定计划进行实验，通过3年的实验研究，已完成了所有预定研究目标：构建了纸基石墨烯阵列芯片，完成了纸基石墨烯阵列芯片的表征、修饰及表面功能化，筛选出适合本研究的纸基石墨烯阵列芯片电极，优化了探针在纸基石墨烯阵列芯片电极上的包被条件和DSN酶最适反应条件，构建了基于纸基石墨烯阵列芯片结合DSN酶信号放大系统，实现了无扩增痕量miRNAs直接检测。通过方法学评价，探讨了该方法用于检测的灵敏度、特异性，并且与现有的方法学进行了比对以证明其有效性。进一步为提高纸基石墨烯阵列芯片电极纳米尺度空间范围内靶标特异性识别及其微弱检测信号的级联放大，采用杂交链式反应结合四面体结构探针，实现纳米尺度范围内探针与靶标识别捕获的可控性，完成了多探针同步检测的验证，实现了无需扩增多联核酸直接检测，并探索了临床样本检测的可行性。在此基础上，进一步探索了液体活检新技术的开发与应用，为疾病的早期诊断提供支持。.本课题历时3年，共发表文章4篇，其中SCI论文2篇，2 篇相关研究内容的SCI论文在投中。本课题共申请发明专利5件，其中2件获得了国家发明专利授权。本项目的顺利实施为后续基于纳米材料的生物应用研究奠定了坚实的理论和实验基础，对于研发相应的检验设备具有重要意义，为拓展纳米生物传感技术的在体应用奠定了基础。