XPA-RPA复合物参与核苷酸切除修复通路DNA损伤确认的关键组装机制研究

Nucleotide excision repair pathway is able to remove a wide range of DNA lesions caused by ultraviolet irradiation and chemotherapy drugs, and this pathway is directly related to the development of xeroderma pigmentosum and the resistance to chemotherapy drugs in cancer cells. Human XPA (xeroderma pigmentosum, complementation group A)-RPA (replication protein A) complex play significant roles in verifying DNA damage and recruiting downstream endonucleases to facilitate the repair of DNA lesions in nucleotide excision repair pathway. However, the mechanism of XPA-RPA complex assembling around the sites of DNA lesion in nucleotide excision repair pathway remains unclear. In this study, we plan to determine the three-dimensional crystal structure of XPA in complex with branched double-stranded DNA and the structure of multi-component complex containing XPA, RPA and branched double-stranded DNA. Based on these structures, the mechanism of XPA-RPA-DNA interaction will be revealed at the atomic level. Furthermore, we can depict the precise assembly mechanism of XPA-RPA complex around the sites of DNA lesion, demonstrate the crucial role of XPA-RPA complex in nucleotide excision repair pathway, and discuss the influences of disease-associated amino acid mutations on the biological functions of XPA. This study might provide a new insight into the pathogenic mechanism of xeroderma pigmentosum, and provide a potential structural basis for the rational design and optimization of the hits of chemotherapeutic sensitizers via blocking the interaction between XPA and RPA.

核苷酸切除修复通路能够修复紫外线和化疗药物引起的DNA损伤，该通路与着色性干皮症的发生及癌细胞对化疗药物的抗性直接相关。人XPA(着色性干皮症互补组A)-RPA(复制蛋白A)蛋白复合物参与核苷酸切除修复通路且在确认DNA损伤及招募下游核酸内切酶等方面起到关键作用。然而XPA-RPA复合物在DNA损伤位点附近的组装机制仍是未解之谜。本项目通过解析XPA-分支双链DNA复合物及XPA-RPA-分支双链DNA大型复合物的三维晶体结构，在原子分辨率水平上首次揭示XPA-RPA-DNA相互作用的机理及XPA-RPA复合物在DNA损伤位点附近的精细组装机制，阐明XPA-RPA复合物参与核苷酸切除修复通路的关键角色，探讨与疾病相关的XPA突变对其功能的影响。本项目能够为着色性干皮症的发病机理提供新的见解，也为潜在的针对阻断XPA-RPA相互作用的化疗增敏苗头化合物的理性设计和优化提供结构基础。

环境因素和代谢产物能够诱导产生DNA损伤，修复受损的DNA是维持生物基因组稳定性所必需的。核苷酸切除修复(NER)通路能够修复紫外照射引起的DNA损伤，从而与着色性干皮症的发生直接相关。同时，NER通路能够修复化疗药物引起的DNA损伤，导致癌细胞对化疗药物的抗性。人XPA(着色性干皮症互补组A)-RPA(复制蛋白A)复合物是参与NER通路的关键蛋白，其在DNA损伤确认及下游蛋白招募等方面起重要作用。本项目利用蛋白质晶体学的方法研究XPA-RPA复合物参与NER通路的结构生物学机制。我们解析了XPA的DNA结合结构域(XPADBD)的三维晶体结构，衍射分辨率为2.06 Å。结构分析发现XPA的C端21个残基的延伸折叠为长的α螺旋，并且具有明显的碱性氨基酸簇，暗示了其在结合DNA底物中的作用。发现了XPA的C端区域可能会发生结构改变，以便加强与DNA底物的结合能力。通过进一步研究，我们获得了分辨率为2.81 Å的XPADBD结合底物DNA的复合物晶体结构。XPA利用10 bp的识别花样以非序列依赖性的方式结合底物DNA，XPA的特征性β发卡结构中的Trp175残基嵌入DNA双螺旋的最后一个碱基对以形成稳定结构。结合DNA后的XPA将会发生构象变化，XPA的α5螺旋向DNA小沟方向移动，以便更好的结合DNA底物。同时，XPA-DNA的相互作用不会明显弯折DNA底物。我们鉴定了XPA与底物DNA相互作用的关键氨基酸残基，完成了XPA-RPA-DNA复合物的分子模型构建。本研究在原子分辨率水平上阐明了XPA 识别分支DNA 的结构生物学基础，明确了XPA在DNA损伤位点附近的精细组装机制，揭示了XPA-RPA复合物参与核苷酸切除修复通路的关键角色。本项目能够为XPA相关着色性干皮症的发病机理提供新的见解，为靶向阻断XPA-DNA相互作用的化疗增敏药物的理性设计提供了结构基础和新的思路。