基因组水平上DNA复制对核苷酸切除修复的影响研究

Nucleotide excision repair is the sole mechanism to remove DNA bulky adducts like UV-induced lesions in humans. Bulky adducts can interfere with DNA replication and transcription, cause mutation and finally result in skin and other cancers. Cellular nucleotide excision repair may be affected by many factors such as chromatin structure, transcription and DNA replication. To investigate the influence of these factors, the applicant has developed two high-throughput sequencing-based methods to map the precise position of bulky adducts and their repair in the whole human genome and revealed how damage formation and repair are affected by chromatin structure, transcription and other factors. Furthermore, although DNA replication is tightly related to bulky adduct-induced mutagenesis, it is still unclear how DNA replication affect nearby nucleotide excision repair, because DNA replication is a global and dynamic event in the whole genome. In order to answer this question, this study will examine the distribution of UV-induced damage and their repair in cells of both early-S and late-S phases. In combination with DNA replication-timing data and other genomic data sets, we will analyze the genome-wide effect of DNA replication on local DNA repair. This project aims to unveil how DNA replication affect nearby nucleotide excision repair and improve our understanding of the mutagenesis of cancer genome.

核苷酸切除修复是人类唯一能修复紫外损伤等DNA加合物损伤的途径，而DNA加合物损伤可以干扰DNA复制与转录、引起碱基突变，最终诱发皮肤癌等癌症。细胞内的核苷酸切除修复会受到基因组上染色质状态、DNA转录与复制等因素的影响。为了研究这些因素的影响，申请人建立了准确检测基因组上损伤和修复发生位置的高通量测序方法，揭示了基因组水平上染色质状态和转录等因素对损伤形成和修复的影响。然而，尽管DNA复制与DNA加合物损伤导致突变的过程紧密相关，但由于DNA复制是基因组上全局、动态的事件，它对附近区域核苷酸切除修复的影响目前尚不清楚。为了回答这个问题，本研究将检测处于复制早期和晚期的细胞中紫外损伤和修复的分布，结合DNA复制顺序数据以及其它基因组学数据，分析基因组上正在复制的区域附近的损伤修复。本项目的实施，预期将揭示DNA复制对核苷酸切除修复的影响，为癌症基因组中突变的来源提供新的见解。

核苷酸切除修复（NER）是人类唯一能修复紫外损伤等DNA加合物损伤的途径，而加合物损伤可以干扰DNA复制与转录、引起碱基突变，最终诱发皮肤癌等癌症。未修复的损伤被复制时可能会导致突变，DNA复制与修复的过程也可能互相影响。然而，由于DNA复制是基因组上全局、动态的事件，它对附近区域NER的影响难以用传统方法研究。为了回答上述问题，本项目利用细胞周期同步化的策略，用多种高通量测序技术同时测量并分析HeLa细胞DNA复制、UV损伤以及NER在基因组上的分布。研究发现，DNA复制可以通过松弛局部染色质结构来促进附近区域的NER。此外，在复制起点附近前导链的损伤比滞后链少，相对修复速度更快，这种差异在迟复制区域更明显。然而，该差异与复制本身没有直接关系，而是由于复制起点附近滞后链上有更多的T。相应地，在皮肤癌基因组中，迟复制区域的复制起点附近滞后链上的突变更多。研究癌症基因组的突变分布对追踪癌症起源与发展非常重要，本研究不仅回答了DNA复制如何直接影响附近区域的NER，还为癌症基因组中突变分布的链不对称性的来源提供了新的见解。.上述研究中，检测修复分布采用的是XR-seq技术，其存在操作繁琐、效率较低等缺点。因此，我们利用3’末端转移结合5’接头连接的策略，建立了ATL-XR-seq技术，避免了接头二聚体的产生，从而简化了操作，提高了效率。新方法为从基因组水平上研究NER提供了有力的工具。.蛋白与损伤的相互作用是研究修复的分子机制的关键问题，我们结合ChIP与Damage-seq开发了PADD-seq技术，能检测蛋白与DNA加合物的结合位点在基因组上的准确分布。利用该方法，我们成功检测了RNA聚合酶II与UV损伤的动态结合，以及组蛋白H3K9乙酰化与顺铂损伤的相互作用。以上结果表明PADD-seq可以用于研究DNA修复以及损伤应答的分子机制。