穿心莲内酯抗菌作用靶机制的基因组学高通量分析和确证

金黄色葡萄球菌是引起人类和动物临床感染的最主要的一种病原菌，其耐药菌株的播散大大增加了治疗难度。因此，找到新的治疗方案或有效药物已成为现阶段刻不容缓的任务。穿心莲内酯为天然植物穿心莲的主要成份，具有较强的抗菌活性，被誉为天然抗生素药物，但其抗菌作用机制至今不清楚。本课题拟借助细菌全基因组芯片平台,选择金黄色葡萄球菌ATCC25923作为模式菌，首先通过药敏试验及亚抑菌浓度下生长曲线确定给药剂量和作用时间，通过芯片杂交技术记录模式细菌在药物压力下的基因变化，再利用SAM等生物信息学技术软件分析穿心莲内酯影响金黄色葡萄球菌生长的代谢通路，进一步通过荧光定量PCR、Western-blot进行确证，用激光扫描共聚焦显微镜观察细菌在药物压力下的表型变化，分析基因变化与表型的相关性，从而阐明穿心莲内酯对金黄色葡萄球菌的抗菌作用靶机制，为穿心莲内酯作为先导化合物进一步开发应用及新药靶标筛选奠定基础。

穿心莲是传统中草药，具有有清热解毒、凉血消肿作用，在临床上广泛应用。穿心莲内酯为天然植物穿心莲的主要成份，具有较强的抗菌活性，被誉为天然抗生素药物，但其抗菌作用机制至今不清楚。金黄色葡萄球菌是一种广泛存在的重要致病菌，可引起人类和动物许多严重的感染。其耐药菌株的播散大大增加了治疗难度。因此，找到新的治疗方案或有效药物已成为现阶段刻不容缓的任务。本研究首先根据CLSI推荐的最低抑菌浓度实验方法，同时采用时间-杀菌生长曲线研究了穿心莲内酯对金黄色葡萄球菌的体外敏感性。研究结果穿心莲内酯对所检测的21 株金黄色葡萄球菌MIC 值在128-1024µg/ml，MIC90 是512 µg/ml，另外穿心莲内酯对标准菌株ATCC25923 的MIC值为256µg/ml。借助细菌全基因组芯片平台，选择金黄色葡萄球菌ATCC25923 作为模式菌，首先通过药敏试验及亚抑菌浓度下生长曲线确定给药剂量和作用时间，通过芯片杂交技术记录模式细菌在药物压力下的基因变化，再利用SAM 等生物信息学技术软件分析穿心莲内酯影响金黄色葡萄球菌生长的代谢通路，用128μg/ml穿心莲内酯处理金黄色葡萄球菌ATCC25923 细胞30min 后，应用Affymetrix 金黄色葡萄球菌基因芯片检测全基因组表达谱的变化，聚类分析基因芯片数据。基因芯片分析显示135个基因发生显著变化，其中，73个基因显著上调，62个基因显著下调。对穿心莲内酯处理金黄色葡萄球菌后变化的基因进行功能聚类分析。引起变化的基因包括膜生物能编码基因，氨基酸代谢及相关分子，核苷酸代谢，辅酶和辅基代谢，糖代谢及相关分子，毒力因子，脂质代谢，转运子基因，未知功能基因，无类似基因等。进一步通过荧光定量PCR、Western-blot 进行确证，用激光扫描共聚焦显微镜观察细菌在药物压力下的表型变化，分析基因变化与表型的相关性。其中，α-溶血素是金黄色葡萄球菌最重要的毒力因子之一。本课题还获得中草药穿心莲提取物，通过最低抑制浓度值测定、溶血活性测定、Western-blot、荧光定量PCR、LDH及Live/dead等方法研究分析穿心莲提取物对金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌的影响及对A549细胞的保护作用。表明穿心莲内酯及提取物是具有潜在的抗金黄色葡萄球菌感染的药物，为穿心莲内酯作为先导化合物进一步开发应用及新药靶标筛选奠定基础。