家蚕组织蛋白酶D基因表达调控的分子机制

组织蛋白酶D在家蚕变态发育过程中起着重要的作用，但其调控变态发育的分子机制尚不清楚。研究家蚕组织蛋白酶D（BmCatD）表达调控的作用机制，为明确家蚕乃至昆虫变态的分子机理，人为控制蚕蛹发育过程，具有重要的理论和实践意义。本项目拟以能感染AcMNPV的家蚕为研究材料，通过构建含BmCatD调控元件启动子的双荧光AcMNPV表达载体，结合碱基突变，明确影响BmCatD基因表达的调控元件；利用蛋白质与双链DNA互作、蛋白质纯化及质谱分析技术，获得调控元件的结合蛋白；再结合生物信息学、电子克隆及5'RACE获得转录因子的基因序列，研究其识别位点，并利用普通杆状病毒载体表达、real-time PCR分析等进一步验证转录因子的功能等。提出调控家蚕变态发育的分子机制。

研究了在家蚕杆状病毒(BmNPV)和昆虫激素（蜕皮激素和保幼激素）的诱导作用下，BmCatD基因在转录水平上的表达模式。结果显示，家蚕幼虫—蛹变态过程受杆状病毒(BmNPV)和昆虫激素的调控。.以能感染AcMNPV的家蚕为研究材料，通过构建含家蚕组织蛋白酶D（BmCatD）调控元件启动子的双荧光AcMNPV表达载体，结合Over-lap PCR基因定点突变方法，重点研究了该基因启动子调控元件在家蚕体内的表达活性。结果表明，该基因启动子中3个蜕皮激素响应元件（EcREs）直接参与了BmCatD启动子活性的调控，且临近转录起始位点的EcRE1元件调控作用影响最大；通过对该基因启动子序列5’端顺次缺失分段，发现在转录起始位点上游-1214至-925片段存在未知的转录调控抑制元件，进一步部分碱基删除，确定了该反式调控因子为位于-1071至-1038序列的33bp；以获得的33bp序列设计生物素标记引物，从家蚕幼虫脂肪体中分离出结合蛋白，在质谱鉴定的基础上基因克隆了转录因子的cDNA全长序列；结合Gateway技术，对该转录因子在真核表达系统中进行了过表达和RNAi抑制表达的功能验证。研究结果提示，位于BmCatD基因启动子起始位点上游33bp（-1071到-1038）的序列为调控该基因表达的核心区域。