家蚕Helitron转座子调控邻近基因表达的分子机制以及在家蚕生物反应器研发中的应用

Helitron transposons were discovered about ten years ago and classified as a novel DNA transposon superfamily. They are widespread in eukaryotic genomes. Most previous studies mainly focused on the genome-wide identification of Helitrons. However，functions of Helitrons remain unknown. Recently, we have performed genome-wide identification and functional studies of Helitrons in the silkworm. The results suggested that the silkworm genome harbors at least 21 Helitron families and that some silkworm Helitrons can significantly enhance the expression of nearby genes. However, the mechanism for Helitrons regulating the expression of nearby genes is unclear. In this project, RT-PCR, qRT-PCR, western blotting, dual-luciferase reporter assay system, cell transfection, EMSA and transgenic technology will be used to elucidate the impacts of Helitrons on the expression of adjacent genes, reveal the molecular mechanism of Helitrons regulating the expression of nearby genes, and evaluate application values of Helitrons in the silkworm bio-reactor. Our results will not only provide new knowledge for functions of Helitrons, but also promote the development of silkworms as bio-reactors.

Helitron转座子是十多年前被发现的一类新的DNA类转座子超家族，并广泛分布于真核生物基因组中。目前对Helitron转座子的研究仅停留在全基因组鉴定上，关于Helitron转座子的功能研究仍是空白。我们最近对家蚕Helitron转座子的全基因组鉴定和功能初探发现，有些家蚕Helitron转座子对其邻近基因的表达有显著增强作用。但是，家蚕Helitron转座子增强邻近基因表达的分子机制仍不清楚。本项目将采用RT-PCR、荧光定量PCR、Western blotting、双荧光素酶报告基因系统、细胞转染、凝胶迁移实验和转基因等技术系统研究家蚕Helitron转座子对其邻近基因表达的影响；阐明Helitron转座子调控邻近基因表达的分子机制；评价其在家蚕生物反应器中的应用价值。研究结果不仅对Helitron转座子的功能有新认识，而且有望促进实用家蚕生物反应器的研发。

Helitron转座子广泛分布于真核生物基因组中并以滚环式机制转座的DNA类转座子。不同物种间Helitron转座子结构保守，但是序列相似性低，长度差异大，这给全基因组Helitron转座子的鉴定带来巨大挑战，至今仍没有可在不同物种基因组中准确鉴定Helitron转座子的有效方法，致使相关研究长期停留在Helitron转座子的鉴定和进化分析阶段，进而导致Helitron转座子的功能研究仍是空白。在本项目的资助下，基于Helitron转座子的结构特征设计出全基因组鉴定Helitron转座子的软件—Hel-Miner，结果在家蚕基因组中鉴定出38个Helitron转座子家族，其中20个为先前报道的，18个为新发现的Helitron转座子家族，该方法是基于Helitron转座子的结构特征设计，因此可应用于其它生物，这将有助于新测序物种的基因组组装和注释。进一步通过双荧光素酶报告基因转染实验证明38个Helitron转座子家族中有29个对下游基因的转录具有显著增强作用，增强倍数均在3倍以上，其中BmHel-29和BmHel-34转座子最高可增强下游基因表达~30倍。通过转录因子结合位点分析，碱基定点替换结合双荧光素酶报告基因细胞转染实验揭示增强倍数最高的BmHel-11, BmHel-16, BmHel-29和BmHel-34转座子主要通过提供额外的顺势调控元件来增强下游基因的表达。进一步转基因实验表明BmHel-29转座子在家蚕体内可显著提高（~19倍）外源绿色荧光蛋白（gfp）的表达。上述研究结果揭示家蚕基因组中大部分Helitron转座子具有类似于增强子功能，不仅对家蚕基因表达调控网络具有重要贡献，而且可用于家蚕转基因高效生物反应器表达外源有用蛋白。