1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶作为硫胺素焦磷酸依赖酶的作用机理及其与乙酰乳酸合酶的比较

1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS) is one of the key enzymes in the MEP pathway for isoprenoid biosynthesis. It catalyzes the rate-limiting step of this alternative route and is also an important enzyme in the biosynthesis of vitamins B1 and B6 in some bacteria. In the previous study we observed that in the DXP formation reaction catalyzed by DXS, the key intermediate resulting from the interaction between the substrate pyruvate and the co-enzyme thiamine diphosphate (ThPP) possessed a new resonance structure. The finding has urged us to carry out further research to clarify: i) As a ThPP dependent enzyme, how does DXS mediate the interaction between pyruvate and ThPP? What kinds of intermediates form in the process? What are the differences between these intermediates and the ones form in the reaction mediated by acetolactate synthase (AHAS)? ii) Does the key intermediate in the AHAS reaction also possess the new resonance structure? This proposal plans to interpret these issues and to build up solid base for new antibiotics screening utilizing DXS as a target.

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）是萜类化合物生物合成的MEP途径中的关键酶，它催化的反应是植物及微生物通过该途径合成萜类化合物的限速步骤，它本身也是一些微生物中维生素B1和B6合成的重要酶，同时它还是筛选新抗菌素的理想靶标。我们前期的研究显示，DXS在催化DXP合成过程中，其底物丙酮酸与辅酶硫胺素焦磷酸（ThPP）形成的关键中间体存在一个新的共振结构。这一发现促使我们对DXS作为ThPP依赖酶的作用机理进行深入探讨：1）DXS如何催化丙酮酸与ThPP之间的相互作用？在此过程中形成的中间体是什么？这些中间体与同为ThPP依赖酶的乙酰乳酸合酶（AHAS）的反应中间体有何不同？2、AHAS反应中的关键中间体是否也存在这样的共振结构？本项目拟通过研究为这些问题找到答案，并在此基础上阐明DXS催化合成DXP的作用机理，同时给以DXS为靶标的新抗菌素筛选提供新的思路。

硫胺素焦磷酸（ThPP）依赖酶是以ThPP为辅酶来实现其催化功能的一大类重要生物催化剂，对该类酶催化机理的研究表明，在其催化过程中辅酶ThPP与酮酸底物结合后会形成一个脱羧中间体，一般认为该中间体存在两种共振结构，即C2-正碳离子和烯胺式结构。我们在对萜类化合物生物合成的MEP途径中的关键酶，即ThPP依赖酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）的研究中发现，在DXS催化的反应中除了存在以上两个共振结构外，还可能存在第三个共振结构，即烯醇式结构。为证明该共振结构的存在，我们同时还选择了另外一个ThPP依赖酶，即支链氨基酸生物合成途径中的关键酶乙酰乳酸合酶（AHAS）来开展研究。.我们首先测定了DXS及AHAS催化的反应中的动力学同位素效应（KIE）。在底物KIE及溶剂KIE的测定中我们发现测得的结果均非常接近1.0，这说明在此二酶催化的反应中，由中间体LThPP脱羧形成的中间体HEThPP进而形成三个共振结构（C2a-正碳离子、烯胺式结构和烯醇式结构）的过程可能并非整个反应的限速步骤，因而测不到KIE。在随后以质谱法测定AHAS或DXS催化反应的最终产物中氘标记情况时我们得到了支持烯醇式共振结构存在的重要数据，进一步我们将以1H-NMR对以上数据进行确证。这些结果将对深入阐明ThPP依赖酶的催化机理打下良好的基础。.同时，我们还建立了全面定量分析AHAS催化反应的底物消耗及产物形成和分布的柱前衍生-HPLC方法，并利用该方法测定了多种来源的AHAS/ALS所催化反应的异同；在此过程中我们还发现了AHAS/ALS所催化的双底物反应（丙酮酸 +2-丁酮酸）中形成的几个个新的产物及AHAS酶的调节亚基所具有的对反应底物偏好性的调节作用，这些结果对进一步揭示AHAS/ALS的催化机理有非常重要的意义。.此外，我们还探讨了萜类化合物生物合成的MEP途径中的另一关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）催化反应中的中间体，获得了一些有意义的结果，这对彻底阐明该酶的催化机理打下良好基础。