1-脱氧-D-木酮糖 5-磷酸合酶催化1-脱氧-D-木酮糖 5-磷酸合成及磷酸丙糖异构化的作用机制研究

1-脱氧-D-木酮糖 5-磷酸合酶（DXS）是萜类化合物生物合成的MEP途径中的关键酶，它不仅是通过该途径形成异戊烯基焦磷酸（IPP）及二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的限速步骤，也与细菌及植物中萜类化合物的最终含量密切相关，它也是维生素B1和维生素B6生物合成过程中的重要酶；同时它还是进行新抗菌素筛选的靶标。我们的研究已发现，细菌源（原核生物）的DXS除能催化1-脱氧-D-木酮糖 5-磷酸（DXP）合成外，还具有磷酸丙糖异构化活性。目前关于该酶尚需解决的问题是：1、植物源（真核生物）DXS是否也同时具有催化DXP合成的活性及磷酸丙糖异构化的活性；2、DXS在催化DXP合成过程中的作用机制是什么；3、DXS在催化磷酸丙糖异构化过程中的作用机制是什么。本申请的目的是通过研究为这些问题找到答案，同时给以DXS为靶标的新抗菌素筛选工作提供新的思路。

1-脱氧-D-木酮糖 5-磷酸合酶（DXS）是萜类化合物生物合成的MEP 途径中的关键酶，它不仅是通过MEP途径形成异戊烯基焦磷酸（IPP）及二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的限速步骤，也与细菌及植物中萜类化合物的最终含量密切相关，它也是维生素B1 和维生素B6 生物合成过程中的重要酶。我们的前期研究已发现，细菌源DXS 除能催化1-脱氧-D-木酮糖 5-磷酸（DXP）合成外，还具有磷酸丙糖异构化活性。本研究在我们已完成工作的基础上，利用多种蛋白纯化技术获得了高纯度的DXS蛋白，进而利用核磁共振技术（H-NMR及C-NMR）、气-质联用技术（GC-MS）、液-质联用技术（LC-MS）及同位素交换技术（2-H及18-O）等探讨了它在催化DXP 合成过程中及 在催化磷酸丙糖异构化过程中的作用机制，认为：.1、在DXS催化的两个反应中，磷酸丙糖异构酶化反应总是处于优先地位；.2、与磷酸丙糖异构酶（TPI）类似，DXS催化的磷酸丙糖异构化反应仍然通过一个烯二醇中间体完成；.3、DXS催化DXP合成的反应中，丙酮酸与焦磷酸硫胺素反应形成的中间体羟乙基硫胺素通过进攻上述烯二醇中间体的烯键形成产物DXP。.同时，我们还利用13C-核磁共振、液-质联用技术（LC-MS）及同位素交换技术（18-O）等研究了萜类化合物生物合成的MEP 途径中的另一个关键酶，即1-脱氧-D-木酮糖 5-磷酸还原异构化酶（DXR）的底物结合模式，提出底物DXP与酶DXR的结合是通过其C3及C4上的两个羟基完成的，而不是大家普遍认为的通过底物DXP的C2羰基及C3羟基来完成；在此基础上我们还提出了DXR酶的催化循环，并利用这个催化循环合理地解释了DXR酶在催化2-甲基-D-赤藻糖醇 4-磷酸（MEP）合成过程中所观察到的所有实验现象。