大肠杆菌中羟基四氢嘧啶可控合成体系的构建与调控研究

Hydroxyectoine is an important compatible solute that exists in a wide range of halophilic bacteria. It has excellent osmoprotection and cell-protection properties, and thus has vast application prospect. The problems of unmatched expression of multiple genes in the synthesis pathway, and unbalanced product synthesis and cell growth, seriously restrict the efficient and stable synthesis of hydroxyectoine. Here, we focus on the efficient and controllable synthesis of hydroxyectoine in Escherichia coli, and conduct the following studies. 1) Screen efficient ectoine hydroxylase, and precisely regulate the multiple-gene expression and precursor supply by using different types of promoters, and optimizing copy numbers and RBS for related genes; 2) Properly interfere the expression of related genes in central carbon metabolism using CRISPRi, and dynamically regulate the equilibrium of cell growth and product synthesis. Meanwhile, adopt systems biology approach to explore the key regulation targets that significantly affect the equilibrium of cell growth and product synthesis; 3) Optimize and reconstruct the synthesis system to achieve the efficient and controllable synthesis of the desired product. The strategy for efficient and controllable synthesis of hydroxyectoine in E. coli could provide new ideas and methods for the construction and regulation of synthetic systems for heterologous products in artificial cells.

羟基四氢嘧啶是嗜盐菌中广泛存在的一种重要的相容性溶质，具有优良的渗透保护和细胞保护等功能，应用前景十分广阔。合成途径中多基因表达不匹配、产物合成与细胞生长不协调的问题，严重制约了羟基四氢嘧啶的高效、稳定合成。本项目围绕大肠杆菌中羟基四氢嘧啶的高效可控合成，进行以下研究：1）筛选高效的四氢嘧啶羟化酶，并通过不同类型启动子控制、拷贝数优化、RBS优化等对异源合成途径的多基因表达、前体物供应进行精确调控；2）利用CRISPRi技术对中心碳代谢中相关基因表达进行适度弱化，动态调控细胞生长与产物合成过程的平衡，同时，结合系统生物学分析手段，探索影响细胞生长与产物合成平衡的关键调控靶点；3）再进一步对合成体系进行优化与重构，实现目标产物在人工细胞中的高效、可控合成。本研究通过探索大肠杆菌中羟基四氢嘧啶的高效可控合成策略，可为人工细胞中异源产物合成体系的构建与调控提供新思路与方法借鉴。

羟基四氢嘧啶是嗜盐菌中广泛存在的一种重要的相容性溶质，具有优良的渗透保护和细胞保护等功能，应用前景十分广阔。合成途径中多基因表达不匹配、产物合成与细胞生长不协调的问题，严重制约了羟基四氢嘧啶的高效、稳定合成。本项目围绕大肠杆菌中羟基四氢嘧啶的高效可控合成，进行了以下研究：1）筛选高效的四氢嘧啶羟化酶，并通过不同类型启动子控制、拷贝数优化等对异源合成途径的多基因表达、前体物供应进行精确调控，实现了羟基四氢嘧啶的可控合成。菌株HECT12在摇瓶发酵36 h，生产羟基四氢嘧啶12.12 g/L；2）针对人工细胞生长与羟基四氢嘧啶合成过程中的关键代谢物酮戊二酸的供应问题，通过强化gltA、icd等基因合成增强酮戊二酸合成，并利用一系列弱启动子替换sucA基因启动子，减少酮戊二酸在TCA循环中的消耗，对细胞生长与产物合成进行平衡调控。同时，结合代谢组学分析手段，探索影响细胞生长与产物合成平衡的关键调控靶点；3）进一步尝试将基于esaI/esaR细胞群体效应的动态自调控体系，用于sucA的表达调控，通过对群体感应系统进行优化，获得了较好的平衡调控效果，实现了目标产物在人工细胞中的高效、可控合成，且无副产物四氢嘧啶的积累。最终构建菌株摇瓶发酵36 h生产羟基四氢嘧啶14.93 g/L，转化率为1.678 g/g细胞干重，生产强度为0.415 g/L/h，各项生产指标均为目前报道的最高值，具有重要的工业应用价值。本研究通过探索大肠杆菌中羟基四氢嘧啶的高效可控合成策略，可为人工细胞中异源产物合成体系的构建与调控提供新思路与方法借鉴。