反式-4-羟基-L-脯氨酸合成途径在大肠杆菌中的构建和代谢调控机制研究

trans-4-hydroxy-L-proline (t-4Hyp) is an important unnatural amino acid, with a wide application in food, cosmetic, and pharmaceutica industries. However, some biosynthesis mechanism and metabolic regulation mechanism for t-4Hyp synthesis remained unknown. Due to this, this proposal will attempt to construct and genetically modify t-4Hyp biosynthesis pathway in Escherichia coli for an enhanced t-4Hyp production via microbial fermentaion, and to determine the transcription profiles of E. coli geneome through RNA-sequencing (RNA-seq) techniques. The analysis of these transcriptional changes upon genetic modifications will contribute to the in-depth understanding of metabolic regulation mechanism of t-4Hyp biosynthesis and identification of the promising engineering targets towards further improvement of t-4Hyp biosynthesis.

反式-4-羟基-L-脯氨酸（trans-4-hydroxy-L-proline，t-4Hyp）是一种重要的非天然氨基酸，广泛应用于食品、化妆品和医药等领域。 但在微生物胞内t-4Hyp的合成机理以及合成途径所受到的调控机制尚缺乏比较深入的探讨，本申请以此为出发点，在大肠杆菌中构建t-4Hyp的合成途径并对其进行改造以提高微生物发酵合成t-4Hyp的水平，并通过转录组测序(RNA-seq)技术测定胞内基因的整体转录水平，分析在构建和改造t-4Hyp合成途径前后，细胞内基因转录的变化规律，探讨微生物合成L- t-4Hyp的代谢调控机制，搜寻可能存在的代谢限速节点，从而为进一步理性改造t-4Hyp合成代谢提供理论指导。

L-羟脯氨酸在医药、化妆品和保健品等领域具有广泛的应用前景。以L-脯氨酸羟化酶(P4H)为催化剂生物转化法合成L-羟脯氨酸具有环境友好、反应条件温和和立体和位点选择性高等优势，越来越受到关注。而由于目前P4H的酶活和稳定性仍停留于较低的水平，且缺乏系统的、深入的研究，限制了其开发。为了提高P4H的催化性能，本项目首先从NCBI数据库中筛选了5条P4H的基因序列，通过对5条P4H基因序列进行优化和合成，并在大肠杆菌表达系统中进行克隆，构建了5株L-脯氨酸4-羟化酶基因工程菌，通过SDS-PAGE分析得到3株成功表达P4H的重组大肠杆菌。分别优化3株菌全细胞转化L-脯氨酸合成L-羟脯氨酸的条件，确定了影响P4H活性的关键影响因素，提高了L-羟脯氨酸的产量；并通过对3个P4H酶进行三维结构模拟和“热点”氨基酸预测，对P4H进行定点饱和突变，结合高通量筛选技术，获得了催化性能进一步改善的突变酶F137-41和Y205-90；通过对突变酶F137-41进行基因测序和与原始基因进行比对，发现突变型P4H的基因序列有两处碱基突变，分别是409位的T突变为C，410位的碱基T突变为G，导致137位的氨基酸由Phe突变为Arg（F137R），而突变酶Y205-90的基因序列有两处碱基发生突变，分别是613位的碱基T突变为A和615位的碱基C突变为G，导致205位的氨基酸由Tyr突变为Lys （Y205K）。该结果为P4H的催化机制研究以及L-羟脯氨酸的高效生物合成奠定了一定的基础。