酰胺类杀虫剂对昆虫新靶标细胞内钙离子调控研究

国内大批高毒杀虫剂已被淘汰禁用，我国急需创制对环境友好的高效杀虫剂。鱼尼丁受体杀虫剂高效低毒，引起昆虫体内钙稳态失衡，但其作用机理尚不完全清楚。本项目在电压钳模式下，研究酰胺类杀虫剂对甜菜叶蛾幼虫中枢神经细胞所表达的L型电压门控钙离子通道的作用，在电流钳模式下，研究其对神经动作电位的影响。采用激光共聚焦显微镜技术结合钙离子荧光指示剂测定药物对原代培养的粘虫肌细胞及甜菜叶蛾幼虫中枢神经细胞内游离钙离子浓度的动力学变化，明确钙离子浓度变化的形成途径。总结钙电流抑制率及钙离子浓度变化与活性及结构的定量关系，初步建立钙离子通道抑制剂筛选平台，为合理设计创制新型杀虫剂提供理论依据并合成新型酰胺类杀虫剂。

快速变化的钙信号与肌肉收缩、神经递质传导、激素分泌等重要生理过程直接相关。钙稳态失衡是细胞或生物体受到损伤或死亡的最终途径。 .本项目紧密跟踪国际上鱼尼丁受体杀虫剂这一热点领域，三年的研究中，主要完成了以下工作：.1 实验材料.对鳞翅目昆虫幼虫中枢神经元培养进行改进，本实验室培养的四种（甜菜夜蛾，玉米螟，粘虫，棉铃虫）昆虫幼虫神经元48小时内活性良好，完全满足了实验需要，为后续研究杀虫活性选择性提供不同实验材料。确定了神经元胞浆中及内质网中自由钙荧光负载的最佳条件，尤其是未见报道的昆虫神经元内质网荧光负载(Fluo-5N, 结合力弱)。荧光负载后电压门控钠通道、钾通道及钙通道的通道功能没有变化，钙通道电流的衰减与未荧光负载前一致。 .2 技术方法建立 靶向神经元钙离子通道的杀虫剂作用机制研究方法建立-采用膜片钳结合钙荧光探针（Fluo-3 AM， Fluo-5N）负载技术.对于质膜上的钙通道, 采用膜片钳技术研究药物对电压门控钙离子通道的调控, 非损伤技术研究药物对质膜上配体门控钙离子通道的调控； 胞浆内和钙库内自由钙离子荧光探针分别负载研究药物对胞内配体门控钙通道调控。.3 方法建立后展开的研究工作:.(1) 通道定性：钙离子通道的定性及大电导钾通道电流记录.在项目研究过程中发现粘虫与甜菜夜蛾、棉铃虫神经元质膜上所表达的电压门控钙离子通道类似，经典通道阻断剂对其夜蛾科及螟蛾科昆虫神经元的作用在浓度上有差别。.细胞内钙离子浓度升高可以激活大电导钾通道，产生超极化电流，负责人记录了大电导激活的钾通道电流，为后续工作打下基础。 .(2) 采用全细胞膜片钳技术研究氯虫酰胺及本组新型二酰胺对原代培养的甜菜夜蛾幼虫中枢神经元所表达的L-型电压门控钙通道的调控；经典通道阻断剂对配体门控钙通道作用的测试；荧光测钙研究高活性二酰胺作用机制及苦皮藤I的作用机制系统化研究。.(3) 细胞水平上靶向钙通道杀虫剂筛选模型建立及新型活性化合物设计、合成及筛选.此模型以夜蛾科的甜菜夜蛾幼虫中枢神经元为实验对象，荧光负载后胞外无钙条件下测试施药后钙离子动力学变化。通过对本组及国内其它高校设计合成的一百余个二酰胺类新化合物的荧光探针测钙技术的实验结果表明，化合物的活性与胞内钙离子浓度升高比率呈正相关。通过该模型所预测的新化合物活性与活体实验一致。