稻瘟病菌几丁质酶基因家族的功能研究

几丁质酶作为一种重要细胞壁修饰酶，在真菌的形态建成和极性生长中有着重要作用。稻瘟病菌在侵染水稻的过程中所发生的分生孢子萌发、芽管生长、附着胞和侵入栓的形成，以及侵染菌丝的生长等都涉及真菌的形态建成和极性生长。因此，明确几丁质酶基因在稻瘟病菌生长发育和侵染致病中的作用，既可以进一步揭示该菌发育调控和侵染致病的分子机理，又可以丰富人们对丝状真菌几丁质酶基因功能的认识。前期的研究发现，稻瘟病菌基因组包含有15个假定的几丁质酶基因，本项目将通过实时定量PCR、基因敲除、RNAi和绿色荧光标记等方法研究这些几丁质酶基因在稻瘟病菌生长发育、形态建成及致病性等生理过程中的功能，并利用酵母双杂交方法寻找部分几丁质酶基因在水稻中的互作蛋白基因，初步明确几丁质酶基因在植物与病菌真菌互作中的可能作用，为进一步揭示水稻与稻瘟病菌相互作用的分子机制奠定基础。

几丁质酶作为一种重要细胞壁修饰酶，在真菌的形态建成和极性生长中有着重要作用。稻瘟病菌在侵染水稻的过程中所发生的分生孢子萌发、芽管生长、附着胞和侵入栓的形成，以及侵染菌丝的生长等都涉及真菌的形态建成和极性生长。因此，几丁质酶在稻瘟病菌的生长发育和侵染致病中可能有着重要的作用。研究发现，稻瘟病菌基因组包含有15个假定的几丁质酶，系统发育分析表明，这15个几丁质酶可以分为两大类，CTS1和CTS2，其中CTS2又分为5个亚类（class I-V）。实时定量PCR分析发现，不同几丁质酶基因的表达在稻瘟病菌的生长发育阶段存在差异，说明稻瘟病菌的不同几丁质酶，在病菌生长发育、形态建成和致病性过程中可能有着不同的功能。基因缺失实验发现，Class I中4个基因的单敲除对稻瘟病菌的生长速度、形态，孢子发育和致病性都没有显著的影响。但采用RNAi技术对这4个基因同时沉默后发现，它们的沉默导致了病菌生长速率下降、产孢量减少和致病性降低。ClassⅡ中2个基因的单敲除和双敲除后都不影响病菌的生长发育和致病特性。ClassⅢ中包含MGG_06594和MGG_08054两个基因，其中MGG_06594与病菌的产孢和菌丝黑色素形成有关，而MGG_08054与病菌致病性有关。ClassⅣ基因中，MGG_04534的敲除不影响病菌的生长和致病，但MGG_04534/MGG_01336双敲突变体的生长速率略微减慢，产孢量下降，孢子长宽比增大，致病性减弱，说明ClassⅣ中取主要作用的是MGG_01336。ClassⅤ中只有MGG_04732，该基因突变体的气生菌丝变少，菌落的颜色变白，产孢量减少，细胞壁的完整性受到破坏。CTS1包含4个基因，但它们的单基因敲除，对病菌的生长发育和致病性均无明显影响，说明CTS1同源基因与稻瘟病菌的生长发育和致病性无关，或者存在基因冗余效应。.构建了稻瘟病菌几丁质酶家族所有15个基因的干扰突变体，分析发现，这些基因的干扰导致了病菌产孢量降低，孢子变长，附着胞形成异常，细胞壁的完整性破坏及致病性下降。说明稻瘟病菌的几丁质酶参与病菌的生长发育、形态建成和致病性过程。利用酵母双杂交方法在水稻中筛选到18个与几丁质酶互作的蛋白，对其中的2个蛋白进行了GST pull-down验证，发现1个蛋白参与调控水稻的抗病反应。