耐受性树突状细胞治疗免疫性再生障碍性贫血的研究

再生障碍性贫血(AA)是较常见血液病,免疫失调是其发病主要机制。研究表明AA患者树突状细胞(DC)亚群失衡(DC1/DC2升高)、T调节细胞(Treg)数下降、Th1细胞功能亢进，至今仍被医学界视为"棘手的挑战"。耐受性树突状细胞(tDCs)具有刺激Treg生成,维持免疫稳定作用，在移植排斥的预防和自身免疫性疾病的治疗研究中已获得效果。本研究采用VIP、GM-CSF等因子在体外无血清培养或体内诱导小鼠tDCs,并将其用于小鼠免疫性AA模型的免疫治疗,观察tDCs对AA小鼠生存和造血生成的影响,探索tDCs输注数量与途径,检测tDCs体内嵌合及分布,确定tDCs治疗前后AA小鼠DCs亚群、T细胞亚群及体内细胞因子变化,测定Treg细胞内FoxP3、IL-2和IFN-γ等基因表达变化,研究tDCs对免疫性AA治疗的可行性,建立tDCs治疗AA实验方法,为AA发病机制研究和临床治疗提供理论依据。

本研究取小鼠骨髓细胞，分离单个核细胞。在含GM-CSF、IL-4、VIP、DXM、LPS等因子的RPMI 1640培养基中按不同的组合分为五组进行体外诱导培养，优化耐受性树突状细胞（tolerogenic dendritic cells，tDCs）体外诱导培养方法，建立了含GM-CSF20ng/ml+VIP40ng/ml+DXM10ng/ml培养基诱导耐受性树突状细胞的诱导培养体系。通过小鼠腹腔内注射tDCs和体内示踪观察，建立了tDCs诱导特异性免疫耐受的小鼠动物模型，证明骨髓源性tDC能迁移至受体脾、肝脏、淋巴结，并能形成稳定的嵌合，且维持1月以上。通过小鼠尾静脉输注tDCs，探索了tDCs治疗免疫介导的再生障碍性贫血小鼠的方法。在此基础上，进一步分离纯化tDCs来源的细胞外分泌体（exosome），探索其对免疫介导性再生障碍性贫血模型小鼠造血功能的影响及其在免疫调节中的作用。结果显示: 采用本体外诱导培养体系培养的tDCs输入免疫介导性再生障碍性贫血小鼠体内，可诱导CD4+CD25+调节性T细胞生成，初步提示tDCs能促进小鼠造血功能的恢复。小鼠骨髓单个核细胞体外诱导培养生成tDCs，经超速离心纯化可获得exosome（tDex）。tDex与tDCs具有相似的诱导免疫耐受特性，来源于体外培养tDCs的tDex输注免疫介导性再生障碍性贫血小鼠体内，可诱导CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞生成、Th1/Th2和T-bet/GATA-3基因表达比例下降，促进小鼠造血功能的恢复。本研究为再生障碍性贫血患者提供了一种潜在的免疫治疗新途径。