基于单细胞测序筛选的lncRNA IDDR调控炎症小体NLRP3激活在椎间盘退变中的作用及机制研究

The inflammation, which secretes cytokines mainly composed of proinflammatory IL-1β in nucleus pulposus(NP) cells, is a distinguishing characteristic of the intervertebral disc degeneration(IDD). The inflammasome NLRP3 is the crucial protein complex regulating maturation and secretion of IL-1β. In recent years, it has been highly valued by the international academic community. Recent study show that long non-coding RNAs (lncRNAs) regulate the inflammatory response through multiple channels, but their roles in regulation of inflammasome NLRP3 is remained rare. Through depth single cell sequencing , our research group identify a lncRNA IDDR(IDD relative) as a key regulator which was dramatically down-regulated in IDD NP tissues. We further expand clinical samples to verify the different expression of lncRNA and analyze the feature, secondarily predict and confirm its structure, and establish NP cells pressure model and IDD mice model to study the functions of lncRNA. Our research of the key signaling pathways involved in lncRNA IDDR can explain the molecular mechanism of NLRP3 activation during IDD and provide a new method in IDD clinical treatment and prevention.

髓核（NP）细胞爆发以分泌IL-1β为主的炎症反应是椎间盘退变（IDD）的主要特征，炎症小体NLRP3是调控IL-1β成熟和分泌的关键蛋白复合体，近年来受到国际学术界高度重视，然而炎症小体NLRP3激活的调控机制尚不完全清楚。最近研究发现，长链非编码RNA（lncRNA）通过多种方式调节炎症反应，然而lncRNA调控IDD中炎症小体NLRP3激活的研究甚少。课题组前期对IDD病人NP细胞单细胞测序分析，经筛选验证发现新的关键lncRNA IDDR，在退变后显著性低表达；本项目将通过进一步扩大临床样本量开展lncRNA IDDR差异性表达验证、特征分析；二级结构预测分析及验证；进而通过人髓核细胞压力模型体外实验、鼠尾压力模型体内实验验证其功能，研究NP细胞内lncRNA IDDR在激活炎症小体NLRP3中的作用以及参与的关键信号通路，如能取得预期结果，有望为IDD的临床防治提供新思路。

我们发现人体NP细胞内的NORAD水平随着年龄的增长而降低。随后的功能实验表明，WTAP在衰老的NPCs中增加，这是由于KDM5a介导的启动子H3K4me3的表观遗传增加，并显著促进了NORAD m6A的修饰水平。为了揭示NORAD在衰老过程中的确切作用，进一步的RIP-qPCR检测还显示，PUM1和PUM2与NORAD转录本的结合减少。此外，在siRNA诱导的NORAD缺失NP细胞中，PUMILIO活性增强，维持染色质稳定性相关靶基因ESCO2、LIN9、SMC1A等表达下降。对NORAD转录本进行FISH分析，荧光免疫染色结果表明，NORAD和PUM1/2在NP细胞中共定位并相互作用，经典的椎间盘衰老退变造模因子TNF-α可以减弱这种作用。通过针刺NORAD KO小鼠建立手术诱导的IDD模型，与对照组NORAD KO组相比，阻断KO小鼠PUM1/2可在一定程度上恢复针刺法诱导的IDD变性。椎间盘高度(IDH)的影像学结果和组织学评分进一步证实了这一结论。另一方面椎间盘退变的特征是进行性髓核(NP)细胞死亡和NP组织炎症微环境的发展。过度积累的细胞质DNA作为一种损伤相关分子模式(DAMP)，由cGAS-STING轴监测，在许多退行性疾病中触发免疫反应。NLRP3炎性小体依赖性焦亡是一种炎性程序性死亡，可促进慢性炎症反应和组织退变。然而，cGAS-STING轴与NLRP3诱导的焦亡在IVD退变发病机制中的关系尚不清楚。在这里，我们使用磁共振成像(MRI)和组织病理学来证明cGAS、STING和NLRP3与IVD变性的程度相关。氧化应激诱导人NP细胞cGAS-STING轴激活和NLRP3介导的焦亡，并依赖于STING。在氧化应激下的人NP细胞中，我们观察到线粒体通透性过渡孔(mPTP)随着线粒体DNA (mtDNA)的胞质逃逸而开放的典型特征。此外，在大鼠盘针穿刺模型中，mPTP的特异性药物抑制剂和自体mtDNA胞质渗漏有效地减少了NLRP3介导的程序性NP细胞死亡和体外微环境炎症以及退变进展。总的来说，长链非编码NORAD缺失通过负向调节PUMILIO活性，导致NP细胞衰老，进而加速椎间盘退变；此外，cGAS-STING-NLRP3轴在IVD退变进展中发挥关键作用，并为椎间盘源性下腰痛提供了有希望的治疗方法。