miRNA在水稻抗感黑条矮缩病品种中的表达差异和调控作用

Rice black streaked dwarf virus is becoming one of the most serious problems in affecting rice production in East and North China. Using host defense resistance to cultivate resistant varieties is the most basic fundamental strategy. Plants can activate RNA silencing to against virus infection through regulating resistance genes and silencing of viral genes. miRNA is one of the key components in RNAi mechanism. We use artificial inoculation system of rice black-streaked dwarf virus and field identification to select anti-virus resistance rice variety Su69 and another high susceptible variety HuaiDao 5 as control. Through high-throughput sequencing, qRT-PCR and Northern Blot technologies, we built four small RNA libraries before and after RBSDV infection on susceptible rice varieties and resistant rice varieties respectively. RACE analysis is also used to identify the predicted target genes. To further identify the effects of miRNAs in the rice resistance pathways, we use RNA virus vectors to construct miRNA transient expression system in transformed rice lines.This study may provide a theoretical basis and technical support for the genetic improvement of disease-resistant varieties.

灰飞虱传播引起的水稻黑条矮缩病近年来在我国华东华北稻区爆发流行，利用植物自身抗性培育抗病品种是防治该病毒病的根本策略。RNA沉默机制是植物抵御病毒侵染的重要途径，miRNA是其中的关键组分。申请者利用课题组已建立的RBSDV人工接种体系结合田间鉴定筛选出具有高耐（抗）病水平且专一针对病毒抗性的水稻品种苏69，以高感品种淮稻5号为对照，分别构建两者RBSDV侵染前后的小RNA文库，拟通过高通量测序，获取抗感品种中差异表达的miRNA，并利用定量PCR, RNA杂交和RACE检测等技术，验证候选miRNA的表达水平及剪切功能；并利用RNA病毒载体构建miRNA瞬时表达系统，通过转化水稻株系对调控功能进行验证，以进一步检验miRNA在抗病性分化中的作用，深化对病毒致病及植物抗病机制的认识，为抗病品种的遗传改良提供理论依据和技术支持。

水稻黑条矮缩病（RBSDV）是近年来我国华东稻区最严重的水稻病毒病害，导致稻株矮缩不育。RNA沉默机制是植物抵御病毒侵染的重要途径，miRNA是其中关键性的负调控因子。本研究期望通过挖掘水稻抗RBSDV相关miRNA以了解病毒和植物互作机制。我们利用人工接种鉴定体系筛选出的抗感RBSDV水稻品种，分别构建侵染前后植株茎秆及叶片共8个小RNA文库，通过高通量测序和生物信息学分析获取抗感病品种间差异表达的水稻miRNA，其中31个在抗病品种中上调而在感病品种中下调，有1个在抗病品种中下调而在感病品种中上调，14个miRNA被Northern验证。对差异表达miRNA的靶基因进行预测和功能分类，同时构建降解组库对靶基因的剪切位点进行高效验证，发现多数被剪切靶标的基因位于核内，功能上参与信号转导，激素信号调控，细胞分裂、分化，根尖细胞生长等途径，RT-PCR结果显示部分靶基因在植株侵染后的表达变化与miRNA的变化呈负相关；过表达miR159的T0代植株呈现矮缩，多分蘖，不育等类似病株的性状，但其功能有待于获得T1代植株后再深入研究。以上结果证明RBSDV的侵染造成miRNA的变化从而影响植物的生长发育进程，；文库中还存在大量的病毒小RNA，在基因组上呈连续不均匀的分布并存在大量的“热点”区域，抗感品种间不同的热点区可能有助于构建高效的干扰病毒RNAi载体。我们还首次发现了2个病毒小RNA对水稻基因具有标靶作用，本研究为深化了解病毒致病及植物抗病机制，并为抗病品种的遗传改良提供了理论依据和技术支持。