南蛇藤总萜通过协同抑制Notch和VEGF的表达阻断肝癌血管生成的作用机制

Blocking VEGF alone can reduce tumor microvessel density, separate blocking Notch inhibition of tumor angiogenesis. We confirmed the Celastrus orbiculatus terpenoids extract (COE) significantly inhibited VEGF expression at both the mRNA and protein levels in Hepa1-6. And found that COE significantly inhibited Notch expression in HepG2 cells. On this basis, this study combined with in vitro and in vivo experiments to explore the mechanisms of COE anti-tumor. First, observation directly of the effects against tumor angiogenesis by using of EGFP tag Tg (fli1a: EGFP) y1 zebrafish embryo model. Then, study the mechanisms of the COE against tumor angiogenesis by targeting the VEGF and Notch protein signaling pathway in HepG2 cells.Finally, establish a GFP-tagged HCC nude mouse model to observe the molecular mechanism of COE anti-tumor. To carry out research of this subject, we will find a new target of COE, and a new anticancer drug with independent intellectual property.

单独阻断VEGF可降低肿瘤新生血管密度；单独阻断Notch能抑制肿瘤新生血管功能。我们前期证实南蛇藤总萜明显抑制小鼠肝癌细胞Hepa1-6中VEGF蛋白及mRNA的表达水平。预实验也发现南蛇藤总萜明显抑制肝癌细胞HepG2中Notch蛋白的表达。在此基础上，本研究拟结合体内外实验，探索南蛇藤总萜抗肿瘤的作用机制。首先，利用增强绿色荧光蛋白EGFP标记的Tg（?i1a:EGFP）y1斑马鱼胚胎模型，直接观察南蛇藤总萜对血管生成的抑制作用。然后，以人肝癌细胞为研究对象，探明南蛇藤总萜通过协同抑制VEGF、Notch信号转导通路进而阻断肿瘤血管生成的机制。最后，建立GFP标记的人肝癌HepG2裸鼠模型，观察南蛇藤总萜对VEGF、Notch、肝癌移植瘤及瘤内血管生成的抑制作用，并研究其分子机制。开展本课题的研究，将发现南蛇藤总萜新的作用靶点，为开发具有自主知识产权的抗癌新药奠定基础。

原发性肝癌是富血管性、高度异质性肿瘤，其进展和转移依赖于肿瘤血管的形成。内皮细胞依赖性血管（EDV）和血管拟态（VM）是肝癌进展及转移的两种独立血管系统。单独抑制EDV不能完全阻止肝癌血供，相反会导致肿瘤内部缺氧加重而诱发VM形成。协同抑制EDV与VM是目前抗肝癌血管生成的新认识。.南蛇藤总萜提取物（COE）含有十一种活性成分，前期的研究结果显示COE具有良好的抗肿瘤作用。本研究的第一部分，我们通过体外实验证实，COE能够抑制HUVEC细胞的体外成管，抑制鼠Hep1-6细胞的血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平；体内实验提示COE能够降低荷瘤裸鼠血清VEGF浓度，抑制瘤组织微血管密度（MVD），下调瘤组织VEGF表达。研究的第二部分，通过肝癌手术标本的分析发现Notch1在肝癌组织中的表达与肝癌的上皮间质转化（EMT）及VM形成有关。体外实验显示，在低表达Notch1的HepG2细胞中过表达Notch1可促进肝癌细胞的EMT，增强肝癌细胞的VM能力；TGF-β1可以诱导肝癌细胞的EMT，在此过程中Notch1表达水平升高并出现肿瘤细胞血管拟态。在高表达Notch1的MHCC97-H细胞中敲低Notch1，不仅可以抑制肝癌细胞的VM，同时能够抵消TGF-β1诱导的肝癌细胞EMT及VM形成。由此我们认为Notch1的高表达促进肝癌的EMT可能是其促进肝癌血管拟态的机制之一。这一结论被进一步的裸鼠皮下移植瘤模型实验所证实。在此基础上，我们在体外及体内实验中相应地加入COE进行干预，发现COE可以减少肝癌细胞的VM结构，下调Notch1的表达，抑制肝癌细胞的EMT。综合本项目的研究结果，我们认为COE可协同抑制VEGF及Notch1，同时减少肝癌的EDV生成及VM形成。.本研究的发现，为肝癌的治疗策略提供了新的选择及理论依据，也为COE进一步开发为中药新药提供了工作基础。依托本项目的实施，课题组不仅在国际国内发表了数量可观的高质量论文，还培养了一批优秀的硕、博士科研人才。下一步工作中，课题组将基础深挖南蛇藤对Notch1上下游信号通路的调控作用，进一步阐明Notch1在肝癌血管拟态中的信号网络机制。