全基因组水平PPARγ联合miRNAs、CpG岛甲基化调控脂肪细胞分化机制研究

本项目以全基因组为视角，沿着PPARγ联合miRNAs、CpG岛甲基化调控人类脂肪细胞分化的思路，朝着系统阐述联合调控机制的预期目标展开工作。利用PPARγ通过具有活性的转录复合物调控脂肪细胞分化这一特性，采用人类骨髓间充质干细胞成脂定向培养、流式细胞术、RNA干扰和配体激活等方法，依据待测细胞状态的不同分为四组，各组在鉴定细胞表型特征后，均应用高通量技术进行多时点动态检测，验证后的数据运用生物信息学技术分析获得结果，以分析结果为依托寻找PPARγ调控人类脂肪细胞分化与miRNAs表达差异、CpG岛超（去）甲基化状态之间密切相关的证据，从而在全基因组水平上系统阐明PPARγ联合miRNAs、CpG岛甲基化调控人类脂肪细胞分化的机制，明确这一机制具有重要的理论意义及临床应用价值，为更深刻认识和有效治疗骨质疏松这类骨的退行性疾病提供理论依据。

本项目以hMSCs成脂定向分化过程为研究对象，运用表达芯片、ChIP-chip、转录组测序技术对成脂分化过程进行动态检测，获取5个高通量数据集，对所获数据以成脂显著性通路为研究对象，构建信号通路和基因间相互作用关系网络，从而聚焦到在信号通路中处于关键调控位置的基因，这些分析结果形成了庞大的原始数据集。在完成研究计划的同时，依据专业的发展趋势增加了可变剪接及环形RNA的检测，为从不同角度深入开展此项研究奠定了良好前期基础。.表达芯片数据提示PPAR信号通路是成脂分化网络的一个重要的发起者，同时MAPK信号通路和细胞周期通路位于成脂分化的信号转导末端，且可能是成脂分化第14天（AD14d）过程中最重要的信号通路。进一步通过表达芯片与ChIP芯片（PPARγ&RXR-ChIP）联合分析，结果经筛选验证发现PPARγ调控成脂分化过程中四个新的靶基因EXOSC8、FUT8、GNG10和HIST2H2AA3。转录组测序数据显示成脂分化第7天与中、后期各时点差异性最大，而中、后期（14、21和28天）之间数据相似度较高，转录组mRNA数据分析获得成脂分化AD0d（hMSCs）、7d、14d和21d各个时间点的26种差异基因表达变化趋势，差异最显著的类型编号依次为4、21、1、24，均为分化早、中期（AD7d/14d）显著上调或下调变化趋势，而后期变化趋势不明显。提示：hMSCs成脂定向分化早、中期的转录调控在成脂分化过程中至关重要。为后续验证时点的选择提供了依据。在microRNA数据分析中，重点分析AD7d的miRNA和mRNA表达完全相反这一类型，从而筛选到miR-1285-3p、miR-593-3p等34个miRNA和对应的1188个候选靶基因。在新增可变剪接数据检测中，获取了转录组水平成脂分化过程中的RNA可变剪接的动态变化，结果发现不同时期均有大量独有的可变剪接位点，其中以AD7d最多，各分化时点比照hMSCs获得124个可变剪接位点的共同交集，其中ECHS1和ACOT7位于脂肪酸代谢显著性信号通路之中，且二者在成脂分化的各时点均发生可变剪接，探究这种现象的原因及机制将是未来研究关注点之一。.海量高通量数据集的分析和验证为进一步深入研究指明了方向，为功能研究奠定了良好基础，最终不仅可能为诊断肥胖和骨质疏松等相关疾病提供新的标记物，而且有望成为新的治疗靶点。