全基因组甲基化CpG岛扩增技术的建立及在食管癌早期诊断中的应用

建立可用于临床微量样品甲基化分析的GWAM-qMSP (Genome-wide amplification of methyl-CpG island and quantitative methylation specific PCR，GWAM-qMSP，基于全基因组平台的甲基化CpG岛扩增及联合定量甲基化特异性PCR）技术，并对食管癌患者全血、活检组织、手术切除组织及刷检细胞中6个基因的启动子甲基化状态及频率进行分析；结合临床病理生物学等参数，探讨多基因甲基化谱与食管癌发生发展的相关性，并最终建立以微量样品多基因甲基化谱为中心分子的食管癌早期快速诊断技术平台；对比分析外周血检测结果，探讨外周血甲基化谱作为食管癌早诊的可能性，为大规模普查食管癌提供一种简便方法。

表观遗传学异常作为肿瘤发生的重要原因，主要包括 DNA 甲基化的丢失、获得、及组蛋白修饰为特征的染色质结构的变化等。已有研究发现启动子异常甲基化在肿瘤的发生发展过程中是一个频发的早期事件, 因此肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤发生的一个早期敏感指标, 被认为是一种有前景的肿瘤分子标志物。当肿瘤发生时, 肿瘤细胞可以释放DNA到外周血中,并在血清/血浆中富集, 其DNA含量比正常人外周血中高出好多倍。研究发现外周血血浆/血清、肿瘤累及器官相关的体液如唾液、痰等中同样可以检测到肿瘤组织中存在的肿瘤相关基因的启动子异常甲基化，这为肿瘤的早期诊断提供了非常有价值的信息。 .课题组以食管癌细胞系KYSE410作实验材料，建立基于全基因组平台的甲基化CpG岛扩增（Genome-wide amplification of methyl-CpG island，GWAM）技术联合实时荧光定量甲基化特异性PCR(Fluorescence-based quantitative methylation specific PCR, qMSP)进行甲基化检测的技术，即GWAM-qMSP检测技术，并应用于临床微量样品甲基化分析。应用已建立的GWAM-qMSP技术对食管癌患者全血、活检组织、手术切除组织及刷检细胞中p16INK4a、p14ARF、MGMT、FHIT、APC和hMLH1 、RARβ2、CDH1等8个基因进行启动子甲基化状态及频率进行分析，经数据整理和统计分析后，结合临床病理生物学等参数，探讨多基因甲基化谱与食管癌发生发展的相关性，同时对比外周血检测分析结果，探讨外周血甲基化谱作为食管癌早期诊断的可能性，为大规模普查食管癌工作提供一种简便方法。GWAM-qMSP技术可以克服起始DNA量太少和在亚硫酸氢钠修饰处理基因组 DNA 过程中不可避免地片段化、丢失等障碍, 大幅度增加可用作PCR扩增的有效模板分子，进而增大从游离DNA甲基化分析来构建原发肿瘤甲基化特征图谱的可能性，有助于寻找敏感、特异标志物用于食管癌早期诊断，并最终建立以微量样品多基因甲基化谱为中心分子的食管癌快速早诊技术平台。.该研究结果在国际肿瘤核心期刊发表SCI收录论文8篇、在中文核心期刊发表论文6篇，授权国家发明专利3项，出版中文专著3部，培养博士后3名，培养硕士研究生8名。