基于表观遗传调控探讨健脾补肾解毒方对骨髓增生异常综合征全基因组CpG岛甲基化的作用研究

本项目在前期工作的基础上，从表观调控的角度，对正常人、低危型骨髓增生异常综合征（MDS）、中危型MDS、高危型MDS、急性髓细胞白血病（AML）患者骨髓单个核细胞全基因组CpG岛的甲基化状态进行检测，通过比较五组全基因组CpG岛甲基化谱以及CpG岛甲基化数量、位点的差异，并结合外周血乳酸脱氢酶、铁蛋白、β2微球蛋白水平，来分析探讨MDS的预后、危险分层、以及向AML转化的趋势；同时，检测分析健脾补肾解毒方干预前后，MDS患者骨髓单个核细胞全基因组CpG岛甲基化谱及CpG岛甲基化数量、位点的差异，来分析健脾补肾解毒方治疗MDS有效的作用机制，从而避免对MDS特定的甲基化基因进行冗余的挖掘工作；并进一步利用southern杂交技术对干预前后的差异位点进行分析，以明确健脾补肾解毒方降低MDS基因CpG岛甲基化的作用靶点。

项目摘要：目的：本研究项目旨在探讨与骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic Syndrome ,MDS）发病机制相关的甲基化调控基因及健脾补肾解毒方改善MDS甲基化状态的有效性和作用机制，为临床治疗MDS提供理论依据。方法：利用MBD（甲基化结合蛋白结构域）亲和层析柱结合第二代高通量测序（Solexa Genomic DNA-Sequencing）技术对MDS不同危度患者、急性髓细胞白血病（AML）患者、正常志愿者以及健脾补肾解毒方干预后MDS患者的骨髓单个核细胞全基因组CpG岛甲基化进行测序和生物信息分析，运用甲基化特异性PCR（MSP）法进行验证；同时对不同危度MDS、AML患者和正常志愿者的血、尿β2-微球蛋白（β2-MG）、SF（血清铁蛋白）、LDH（乳酸脱氢酶）进行检测和分析。结果:(1)随着MDS疾病危险度的升高，全基因组CpG岛甲基化谱、CpG岛甲基化位点、CPG-island甲基化数量与外周血LDH、血尿β2-MG、SF具有较强的平衡相关性；(2)全基因组CpG岛甲基化测序和生物信息分析显示基因启动子（Promoter）上有1763个DMR(差异甲基化区域)由干预前的高甲基化变为低甲基化状态，577个DMR由干预前的低甲基化变为高甲基化状态；(3)健脾补肾解毒方干预后有296个基因由干预前的高甲基化转为低甲基化状态（如ALX4、CALCA、FGF8、SOX17、NPTX2、PA3、TF），150个基因由干预前的低甲基化转为高甲基化状态（如BCL2、TP73、CEBPA）。结论:(1) MDS患者各组全基因组CpG岛甲基化谱、CpG岛甲基化位点、CPG-island甲基化数量、外周血LDH、血尿β2-MG、SF水平与MDS的危度增高具有总体相关性；(2)健脾补肾解毒方有效治疗MDS的重要机制是调整基因的甲基化状态，其依据主要是改善全基因组甲基化谱式，减少甲基化差异基因CPG-island数量，降低甲基化差异区域/甲基化峰 (DMR），调节基因启动子区域CPG-island甲基化状态；（3)健脾补肾解毒方治疗MDS的作用靶点可能是通过甲基化表型（CIMP）途径，影响了一组或多组不同生物学功能和不同分子信号转导通路的基因启动子区域甲基化，导致该组生物学功能相关基因RNA表达发生改变，发挥相应的生物学治疗功能。