重组杆状病毒构建CTL2亚型介导AIED的研究

CTL2 was discovered in the inner ear as a supporting cell antigen that is the target of antibody induced AIED .To study whether inner ear supporting cell antigen CTL2 can be cloned by recombinant baculovirus. Determine if mice immunized with CTL2 will induce AIED and if patients with AIED have antibodies to rCTL2. Mice inner ear CTL2 mRNA was cloned into baculovirus. The purified recombinant plasmid containing CTL2-P1 and CTL2-P2 gene was transfected into sf9 insect cells to express recombinant protein CTL2-P1 and CTL2-P2．The recombinant protein expressed was detected by Western blot and immunofluorescent assay．AIED patient sera were tested for antibodies to purified rCTL2 on western blots and ELISA. The study will elucidate the function of CTL2 isoforms in AIED and provide an important diagnostic marker to detect AIED.

CTL2是AIED的目标抗原之一。利用杆状病毒作载体，将外源基因CTL2-P1和CTL2-P2转染sf9细胞后，通过Western Blot和免疫荧光法来检测CTL2-P1和CTL2-P2的表达，得到高纯度的重组CTL2亚型蛋白。用纯化CTL2亚型蛋白分别免疫小鼠，制备AIED动物模型。收集AIED病人及AIED动物血清， ELISA和Western Blot检测血清中重组CTL2抗体。通过以上研究阐明CTL2亚型在AIED中的作用，同时也为临床上诊断AIED提供一种重要的标志物。

自身免疫性内耳病（autoimmune inner ear disease，AIED）是少数几种经过恰当治疗后可获得较好疗效的内耳病之一。但由于其发病机理仍不清楚，特别是缺乏高度特异性实验室检查方法，使诊断较为困难，没有一个被普遍接受的诊断标准和诊断试验。严格来说，确诊应有病理结果，内耳的不可活检性增加了本病诊断的难度，但对患者体内内耳特异性自身抗体检测是确诊的重要手段。AIED 特异性抗原有哪些，如何利用特异性自身抗体作为患者诊断的标志物仍是目前 AIED 的研究重点。.本研究成功构建了含CTL2亚型P1和P2基因的重组杆状病毒，将外源基因CTL2亚型转染sf9细胞后，通过Western Blot和免疫荧光法来检测CTL2亚型的表达，得到重组CTL2亚型P1和P2蛋白。用纯化CTL2-P1蛋白免疫小鼠，制备AIED动物模型。收集动物血清， ELISA和Western Blot检测血清中重组CTL2-P1抗体；ABR检测小鼠听力变化；用空中翻正反射准确率、接触翻正反射时间及头偏和游泳行为评分评价小鼠前庭功能变化；HE染色显示小鼠内耳病理学变化。结果显示，和对照组比较，免疫后的小鼠模型ABR反应阈明显提高（P<0.01）；小鼠空中翻正反射准确率明显降低(P<0.01)、接触翻正反射时间明显延长(P<0.01)、及实验组小鼠游泳行为学评分显著升高(P<0．01)。实验组耳蜗最明显改变是内耳炎性细胞浸润，耳蜗出现内淋巴积水。研究证实CTL2是AIED的目标抗原；CTL2-P1免疫小鼠可导致自身免疫性听力下降和前庭功能障碍。