表达IBDV 主要保护性抗原的重组杆状病毒构建及其作为疫苗的免疫效果研究

Infectious bursal disease(IBD) is acute, highly contagious infectious diseases caused by infectious bursal disease virus(IBDV).The main prevention and control means are using traditional vaccine, but there are some disadvantages, such as the high cost, the virulence reversion and lacking of immune protection for variant. Baculovirus is a new kind of gene transfer carrier,which can mediate to express the exogenous genes in mammals and bird species cells. The present work aims at the construction of recombinant, non-replication baculovirus mainly expressing the main protective antigen to infect chicken, as well as investigation the immune effect. Gene recombination technologies as well as other technologies are planned to apply on this research. Based on the Bac-to-Bac baculovirus expression system, the effect of different promotors and different regulatory elements on the expression of exogenous genes will be compared and the best promotor type is then going to be determined, the law of coordinated regulation ways among different regulatory elements will be discussed and the best immunogen gene in IBDV two segment genome will also be determined and their expression condition is about to be optimized. Such constructed recombinant, non-replication baculovirus can be directly applied to immunity study of bird species. The final goal of this research is laying foundation for developing new type IBDV vacinnes both theoretically and practically, providing completely new thinking and useful experience for manufacturing other kinds of non-replication live vaccine of viral diseases

鸡传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病毒（IBDV）引起的禽类急性、高度接触性传染病。目前防控主要依靠传统疫苗，但存在成本高、毒力返强及对变异株缺乏免疫保护等缺点。杆状病毒是新型基因转移载体，可介导外源基因在哺乳动物及禽类等非宿主细胞中表达。本研究旨在构建可感染鸡只的表达IBDV主要保护性抗原的重组非复制型杆状病毒，并探讨其免疫效果。采用基因重组等实验技术，以Bac-to-Bac杆状病毒表达系统为研究骨架，比较不同启动子和不同调控元件对杆状病毒表达外源基因的影响，确定重组杆状病毒最佳启动子类型并探讨调控元件的协同调控方式规律；明确IBDV双节段基因组中最佳免疫原蛋白基因并优化其表达条件。构建的非复制型重组杆状病毒可直接用于家禽免疫研究。本研究将为下一步开发IBDV新型疫苗奠定理论和实践基础，同时也为其他病毒性疾病的非复制型活疫苗开发提供崭新思路和有益借鉴。

鸡传染性法式囊病（Infectious bursal disease，IBD）是禽类急性、高度接触性传染病，由传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起。鸡受到 IBDV 感染后，法氏囊会逐渐萎缩，最终导致鸡只死亡，使养殖业蒙受经济损失。目前防控主要依靠传统疫苗，但存在成本高、免疫耗时及对变异株缺乏免疫保护等缺点。因此，新型疫苗是改变目前恶劣形式的主要手段。杆状病毒是新型基因转移载体，可介导外源基因在哺乳动物及禽类等非宿主细胞中表达。为使杆状病毒更适合传递基因，本研究首先筛选可在鸡原代细胞中高水平表达外源基因的强启动子，然后向具有强启动子的杆状病毒基因组上添加 VSV-GED、WPRE、ITRs 调控元件进行遗传修饰改造以获得非复制的假型杆状病毒。以 IBDV 主要免疫原蛋白 VP2、VP2/4/3 作为研究对象，将其基因分别克隆到假型杆状病毒转移载体中，获得重组杆状病毒并将其直接用于家禽免疫研究，比较免疫效果，筛选最优的免疫原蛋白。本研究得到以下结论：（1）CMV是鸡原代细胞中启动外源基因表达效率最高的最佳启动子；（2）明确了VSV-GED调控元件可以增加杆状病毒对细胞的转导效率，WPRE调控元件可以提高外源基因的表达水平，并可以避免丁酸钠盐对细胞的毒害作用，ITRs调控元件可以适当延长外源基因的表达时间；（3）IBDV双节段基因组中最佳免疫原蛋白基因为VP2/4/3多聚蛋白基因，在VP4蛋白酶的引导下，VP2蛋白形成正确的构象，而且VP3对VP2抗原决定簇位点构象起到稳定和优化的作用，使免疫原性增强；（4）利用重组杆状病毒疫苗直接免疫鸡群，与商品化疫苗对比，获得了更佳的免疫效果，由此搭建重组杆状病毒疫苗平台。本研究构建的非复制型重组杆状病毒疫苗兼具亚单位疫苗和DNA疫苗的双重优势，杆状病毒双表达系统在昆虫细胞中形成病毒样颗粒，再感染鸡原代细胞介导外源基因的表达。由于其在禽类细胞中不复制，所以与传统弱毒疫及基因工程活载体疫苗相比具有良好的生物安全性。本研究不仅为下一步开发防治 IBDV 新型疫苗奠定理论和实践基础，同时也为防治其他病毒性疾病的非复制型活疫苗开发提供崭新思路和有益借鉴。