氟非尼酮通过RIPK1-RIPK3-MLKL信号通路调控细胞坏死及炎症反应的研究

Inflammation promotes the pathogenesis of renal interstitial fibrosis. Renal tubular epithelial cell necrosis is involved in the the pathogenesis of renal interstitial fibrosis. Previous studies reveal necrotic cells can release inflammatory factors and regulated by the RIPK1-RIPK3-MLKL pathway. In our previous work, we observed fluorofenidone strongly inhibit the expression of many inflammatory factors. Moreover, fluorofenidone inhibit the inflammatory response induced by necrotic cells and expression of RIPK3. But the mechanism of fluorofenidone for anti-inflammatory effect has not been fully elucidated. So, We speculate that fluorofenidone could affect the inflammatory response by inhibiting cell necrosis to ameliorate renal interstitial fibrosis. In order to reveal the anti-inflammatory molecular mechanisms of fluorofenidone,We will be in renal tubular epithelial cells and UUO model as the research object to discuss the following questions: ①whether fluorofenidone inhibit inflammation by suppressing Renal tubular epithelial cell necrosis; ②whether fluorofenidone inhibit Renal tubular epithelial cell necrosis by suppressing RIPK1-RIPK3-MLKL pathway.

炎症反应可促进肾间质纤维化的发生。肾小管上皮细胞坏死参与了肾间质纤维化的发病过程，细胞坏死后可释放大量炎性介质，而最新研究表明上述过程是由RIPK1-RIPK3-MLKL信号通路调控的。本课题组前期研究发现抗肾间质纤维化新药氟非尼酮对多种炎性因子均有明显抑制作用，进一步发现氟非尼酮可以抑制细胞坏死导致的炎症反应以及RIPK3的表达，但其抗炎作用机制尚未完全阐明。由此，我们认为氟非尼酮可能通过抑制RIPK1、RIPK3、MLKL的生物学作用从而抑制肾小管上皮细胞坏死，从而发挥抗炎、抗肾间质纤维化的作用。为进一步明确氟非尼酮在肾间质纤维化病程中的具体作用机制，本课题组将以肾小管上皮细胞及UUO模型为研究对象对以下问题进行探讨：①探讨氟非尼酮是否通过抑制肾小管上皮细胞坏死来发挥抗炎、抗肾间质纤维化作用。②探讨氟非尼酮是否通过影响RIPK1-RIPK3-MLKL信号通路来抑制肾小管上皮细胞坏死。

肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病发展为终末期肾病的共同通路，细胞死亡和无菌性炎症是导致肾间质纤维化的重要病理机制。组织损伤过程中发生的细胞坏死往往会引起无菌性炎反应，程序性细胞坏死是近年来发现的一种主要由RIPK3介导的不依赖于caspase的细胞死亡方式。氟非尼酮是一种新研发的能够有效改善肾间质纤维化及其过程中产生的炎症反应的小分子化合物，本课题的目的是探讨AKF-PD是否通过抑制RIPK3介导的程序性细胞坏死改善肾间质纤维化。通过对C57BL/6J小鼠进行单侧输尿管结扎（UUO）后，给予AKF-PD（500mg/Kg/d）或Nec-1(1.65mg/Kg/d）进行治疗，分别在给药3天和7天后处死小鼠，收集梗阻侧肾脏和血清。我们发现给予AKF-PD和Nec-1治疗后，UUO小鼠肾小管损伤、炎症细胞浸润、胶原沉积等现象均有所改善；同时，促炎因子IL-1β、TNF-α和趋化因子MCP-1表达均下降；进一步研究发现AKF-PD和Nec-1可以改善UUO小鼠细胞坏死状况，降低血清LDH水平；在给予AKF-PD和Nec-1治疗后，小鼠肾组织RIPK3和MLKL的表达也明显下降。在体外细胞实验中我们发现，AKF-PD，Nec-1和NSA能够下调TNF-α和Z-VAD刺激的肾小管上皮细胞上清促炎因子IL-6，IL-8和趋化因子MCP-1的表达，同时AKF-PD和Nec-1能够抑制肾小管上皮p-MLKL和RIPK3的表达。综上，AKF-PD和Nec-1均能有效改善肾间质纤维化及其炎症，AKF-PD可能是通过RIPK3介导的程序性细胞坏死发挥其抗炎抗间质纤维化作用。