新型表皮生长因子受体抑制剂修饰的肿瘤靶向纳米脂质载体的研究

本研究拟在前一个国家自然科学基金科学部主任基金项目"表皮生长因子受体介导的具有肿瘤靶向性的纳米脂质载体的研究"的基础上进一步对所构建的靶向肿瘤表皮生长因子受体（EGFR）的纳米脂质载体（NLC）给药系统进行结构优化，并从细胞和动物水平验证设计载体的EGFR靶向性及双重抗肿瘤协同效果。首先，制备聚乙二醇硬脂酸酯修饰的羟基喜树碱长循环NLC，通过体内及细胞水平评价载体避免网状内皮系统吞噬的效果，考察载体在荷瘤裸鼠体内的药效。随后，采用序列/结构分析设计并合成了来源于不同EGFR自磷酸化位点的氨基酸序列小肽，通过细胞和动物试验筛选出高特异性的肿瘤靶向小肽配体，并证明其潜在的抗肿瘤活性。最后，通过电荷或键合作用将活性较强的EGFR 小分子肽类抑制剂与PEG-NLC偶联，通过细胞学和生物学实验验证构建的新型EGFR小分子肽类抑制剂偶联的PEG-NLC对实体肿瘤产生的双重抑瘤和主动寻靶的效果。

本项目是在国家自然科学基金科学部主任基金项目“表皮生长因子受体介导的具有肿瘤靶向性的纳米脂质载体的研究”的基础上进一步对所构建的靶向肿瘤表皮生长因子受体（EGFR）的纳米脂质载体（NLC）给药系统进行结构优化，并从细胞水平和动物水平验证设计载体的EGFR靶向性及其抗肿瘤效果。本课题组在依托单位沈阳药科大学的支持下，通过与齐齐哈尔医学院等单位的紧密合作，按计划顺利完成了研究计划的全部内容。. 研究过程中，我们首先设计并合成了来自EGFR主要自磷酸化作用位点的小肽序列EYINQ(Y1068), AEYLR(Y1173)，PDYQQD(Y1148)，用western blot研究了3个小肽的体外自磷酸化抑制作用，其中AEYLR小肽的活性最强；然后用FITC标记小肽，并用计算机辅助设计筛选的EGFR靶向小肽LARLLT作为阳性对照，无关肽RALEL作为阴性对照，通过与高表达EGFR的细胞及几乎不表达EGFR的细胞进行细胞结合试验和内吞试验，筛选出高特异性的EGFR靶向小肽配体AEYLR；通过ELASE、免疫化学、MTT试验，进一步确证AEYLR的体外靶向性和安全性；再以近红外染料Cy7为探针，成功建立了A549嫁接的裸鼠模型，通过小动物近红外荧光活体成像试验验证AEYLR体内靶向性。. 将AEYLR与聚乙二醇（PEG）修饰的NLC(A-NLC)偶联，优化偶联条件，构建EGFR靶向NLC载体，并对其理化性质进行表征；以FITC为探针，通过EGFR高表达的细胞的内吞试验证明所构建载体的体外靶向性；以DiR为探针，通过活体成像实验验证所构建载体内的体内靶向性；最后，将所构建载体包载化疗药物羟基喜树碱(HCPT)，研究其理化性质及体外释药特征，通过MTT及A549嫁接的裸鼠药效学试验，验证构建载体能提高化疗药物疗效降低毒副作用的功能。. 本项目首次筛选了含有5个氨基酸的靶向EGFR的小肽配体（已申报中国发明专利），并将其连接在新型药物载体NLC表面，提高了药物载体对EGFR高表达的肿瘤的靶向性，相关研究国内外未见报道。在项目完成过程中，培养了博士后2人次，博士3人次，主办了2次大型国内外学术合作交流活动并派出课题组成员赴美国北卡大学等留学交流访问，完成国际刊物（SCI）论文2篇，项目负责人获得全国第十二届吴阶平-保罗杨森医学药学研究奖（药学2名，医学8名）。