bHLH转录因子调控钝鳞紫背苔联苄和黄酮生物合成的机制研究

Bisbibenzyls were a kind of polyphenol compounds isolated from liverworts and exhibited excellent antifungal and antitumor activity. The biosynthesis of bisbibenzyls was derived from phenylpropanoids pathway as flavonoids. Several key enzymes showed dual functional and was involved in the biosynthesis of both bisbibenzyls and flavonoids. bHLH transcriptional factors play an important role in the biosynthesis of flavonoids. Three bHLH genes (bHLH1-3), belonging to Ⅲf subfamily that regulates the biosynthesis of flavonoids, were isolated from a liverwort Plagiochasma appendiculatum. Their expression level was consistent with the content of bisbibenzyls and flavonoids in different tissues. We speculate that these bHLH transcription factors could regulate the biosynthesis of bisbibenzyls and flavonoids. Hence the goal of the present proposal is to investigate the regulatory mechanism of bHLH transcription factors on the bisbibenzyls biosynthesis. The sub-cellular localization and expression pattern will be analyzed. The function of bHLH will be investigated by analyzing the content of bisbibenzyls and flavonoids and the expression of genes of key enzymes in the overexpression and knock-down transgenic P. appendiculatum. Then we will clone the promoters of the target key enzymes and elucidate the regulatory mechanism between the transcript factors and the promoters through EMSA, yeast one hybridization and transient expression. The proteins that probably interact with bHLH will be screened using yeast two hybridization then further confirmed using GST-pull down and BIFC. The success of the proposal should shed light on the regulatory mechanism of the bHLH transcript factors on the biosynthesis of bisbibenzyls and flavonoids in liverworts and lay a basis for the improvement of these active compounds via metabolic engineering.

苔类植物富含一类特有的多酚类化合物双联苄，具有显著的抗真菌和抗肿瘤活性，和黄酮共同来源于苯丙烷途径，前期研究证明几个关键酶都具有双功能，同时参与了两类化合物的生物合成。bHLH类转录因子在黄酮生物合成中起重要调控作用。我们筛选出三个属于Ⅲf亚类(调控类黄酮生物合成)的bHLH转录因子(bHLH1-3)，其表达与钝鳞紫背苔双联苄和黄酮含量呈正相关。在此基础上，拟开展bHLH1-3对钝鳞紫背苔联苄和黄酮合成的调控机制研究，研究其亚细胞定位和时空表达模式，通过检测过量表达及RNAi植物中关键酶基因表达及化合物含量变化确定调控关键酶，克隆关键酶启动子序列，通过酵母单杂交及凝胶阻滞实验研究其与启动子结合序列和调控机制。利用酵母双杂交筛选与bHLH可能相互作用的蛋白。以期阐明bHLH转录因子对苔类植物联苄、黄酮类化合物生物合成的调控机理，并为通过代谢工程提高苔类植物联苄、黄酮类化合物含量奠定基础。

bHLH转录因子调控黄酮类化合物生物合成在维管植物中已经进行了广泛研究，然而在苔类植物中尚未见报道，苔类植物是最早的陆生植物，是最早产生黄酮的植物，而且富含联苄类化合物，课题组前期研究证明联苄和黄酮类化合物都来源苯丙烷途径，共用上游关键酶。本课题从苔类植物钝鳞紫背苔(Plagiochasma appendiculatum)中筛选出三个注释为bHLH家族的基因，与AtTT8、VvMYC1同源性较高，具有典型的Basic- Helix1-Loop-Helix2结构域，与bHLH IIIf亚族归为一族，分别命名为PabHLH，PabHLH1和PabHLH2，因PabHLH和PabHLH2同源性较高，故本课题选择PabHLH和PabHLH1进行研究。利用酵母单杂交技术证明PabHLH和PabHLH1都具有转录激活区，其转录激活活性区位于基因N-端。基因亚细胞定位研究结果表明PabHLH和PabHLH1定位于细胞核。将PabHLH1基因在钝鳞紫背苔叶状体中过量表达，转基因叶状体中联苄类和总黄酮类化合物含量明显增加。荧光定量PCR结果表明PabHLH1上调了联苄和黄酮生物合成相关基因的表达。将PabHLH1在拟南芥中过表达，转基因拟南芥中黄酮生物合成相关基因的表达水平上调，山萘酚衍生物和花色素含量明显增加，说明PabHLH1在拟南芥中调控了黄酮类化合物的生物合成。将PabHLH构建到植物过表达及RNAi载体，转化钝鳞紫背苔愈伤组织和叶状体。PabHLH在过表达愈伤组织和叶状体中的表达水平比空载体对照转基因植物中明显上调，在RNAi转基因愈伤组织和叶状体中表达水平则有不同程度下调。双联苄类化合物含量在过表达植物中明显增加，而在RNAi植物中下降，联苄合成相关基因在过表达植物中上调，而在RNAi转基因植物中下调。为研究PabHLH调控联苄及黄酮生物合成的机制，克隆了关键酶基因STSC1的启动子序列，研究了PabHLH对启动子的调控作用。构建了钝鳞紫背苔酵母双杂交文库，筛选出可能与PabHLH相互作用的蛋白，并通过BIFC实验进行验证，其功能正在研究中。克隆鉴定了苔类植物黄酮生物合成相关关键酶基因，并发现了新颖的催化机制和进化特点。苔类植物转录因子的功能鉴定对阐述高等植物分化前的生物合成途径具有重要的生物学意义，也为通过代谢工程提高天然产物活性成分提供了新的途径。